Рибосоми та рибосомальні рнк

Рибосоми представляють собою універсальні білок-синтезуючі високомолекулярні нуклеопротеїдні комплекси, які присутні як у про-, так і у еукаріотичних клітинах. Типова рибосома складається з двох субодиниць, у кожній з яких є білкова та НК-частина, що представлена рРНК. Тому усі особливості будови та функціонування цього класу молекул РНК нерозривно пов’язані з рибосомою і визначаються її функціональними потребами.

Прокаріотична рибосома 70S має вагу біля 2,5 мільйонів Да та складається з двох субодиниць:

1. 30S (мала) – має біля 20 різних білків та єдину молекулу рРНК довжиною до 1500 нуклеотидів,

2. 50S (велика) – має близько 40 різних білків та дві молекули рРНК – одна (23S) складається з 3000 нуклеотидів, інша (найменша, 5S) – 120 нуклеотидів.

Головною функцією малої субодиниці є контроль взаємодії тРНК з мРНК, а велика регулює пептидилтрансферазну реакцію та приймає участь у каталізі утворення пептидного зв’язку.

Вперше кристалічні компоненти рибосоми прокаріот (деякі білки) були отримані 20 років тому, причому саме вивчення структури рибосоми ведеться вже більше 50 років. За допомогою кристалографії з використанням синхротронів та кластерів важких металів було отримано кристали структури субодиниць рибосом, прогрес у цьому напрямку зведений у таблицю 2 на слайді 32.

Таким чином, перша структура 50S-субодиниці була отримана Беном у 1998 році за роздільної здатності 9 А, пізніше стало можливим досягти значень у 2,4 – 3,5 А – на цьому рівні вже можна розрізнити не тільки індивідуальні бічні ланцюги, а й основи. Однією з останніх були отримані кристалічні форми цілих рибосом E.coli Шавіртом у 2005 році, рибосоми зі зв’язаною тРНК - Коростельовим у 2006 році, та рибосоми з тРНК та мРНК – Селмером у 2006 році. Дані стуктури є чи найбільшими, що були отримані кристалографічними методами. Цікаво відмітити, що вторинні структури рРНК, виявлені у даних рибосомах, мають багато спільного з тими структурами, які були запропоновані у результаті філогенетичних досліджень на основі припущення консервативності цих молекул. Дані про отримані кристалічні субодиниці з додатковими молекулами РНК представлені у таблиці на слайді 33.

Навіть на перших кристалічних структурах цілих рибосом, отриманих Юсуповим у 2001 році, не зважаючи на низьку роздільну здатність картин електронної щільності, можна виявити, що тРНК мала численні контакти з рРНК у складі рибосоми. Пізніше стали відкриватися деталі будови окремих субодиниць, про що ми зараз поговоримо.

Структура 30S-субодиниці. Згідно даних кристалографії, отриманих Уімберлі у 2000 році за 3,0 А, 16S-рРНК, яка має у своєму складі 1511 нуклеотидів, являє собою основу малої субодиниці, навколо неї групуються біля 20 білків, формуючи повний нуклеопротеїд, що складається з чотирьох основних доменів. Домени можуть змінювати розташування один відносно одного, що робить структуру малої субодинці дуже гнучкою. Це дуже важливо, оскільки дозволяє рухи месенджерної та транспортної РНК відносно субодиниці.

Основним формотворчим фактором для малої субодиниці є саме згорнута у третинну структуру молекула рРНК, а білки, схоже, потрібні лише для заповнення проміжків та для підтримання стабільності всієї структури. Це видно із зображення РНК-ового компоненту малої субодиниці (слайд 34).

Особливості будови 16S-рРНК:

1. У вторинній структурі рРНК виявляється аномально велика кількість хеліксних регіонів – їх тут більше 50 на одну молекулу.

2. Така РНК характеризується відносно невеликими петлями між хеліксами, які навіть не порушують напрямок ходу останніх.

3. Між хеліксами існує велика кількість взаємодій, в основному -коаксіальний стекінг через малі борозенки відповідних наближених спіралей, коли вони йдуть у одному й тому ж напрямку. Іноді такі взаємодії навіть порушують структуру А-РНК, як у випадку взаємодії спіралей, коли дві малі борозенки буквально впираються одна в одну.

4. Регіони відхилення від А-форми РНК, як правило, включають у себе послідовності, збагачені на аденін, та характеризуються екстрахеліксними опуклостями та неканонічними парами основ, як у більш простих формах РНК.

5. Іноді, але не так часто, спостерігається так зване перпендикулярне пакування двох хеліксів один відносно одного, також через малі борозенки, яке опосередковується неспареним пурином. Такий метод пакування є особливо важливим, оскільки є характерним для функціонально значимих хеліксів малої субодиниці.

6. У складі 16S-рРНК поруч з нестандартними парами основ спостерігаються також триплети основ та навіть тетра-петлі.

Більшість з 20 білків малої субодиниці мають подібну між собою будову – складаються з глобулярного регіону та довгої гнучкої «руки». Остання є настільки гнучкою, що не виявляється у структурних дослідженнях окремих молекул рибосомальних білків, одначе була спостережена у складі структурі 30S-субодиниці. Такі «руки» відіграють важливу роль стабілізації згортання рРНК, оскільки саме вони заповнюють численні проміжки у згорнутій РНК.

Саме на малій субодиниці було виявлено три важливі сайти, де відбувається основна робота з приєднання аміноацил-тРНК та переміщення пептидил-тРНК, а також де відбувається проофрідинг для виправлення помилок трансляції:

1. Р-сайт (пептидильний) – саме тут антикодон тРНК спарюється з потрібним кодоном у мРНК, а також тут розміщується пептидний ланцюг, приєднаний до ініціаторної тРНК.

2. А-сайт (аміноацильний або акцепторний) – саме тут формуються ковалентні пептидні зв’язки у ході пептидил-трансферазної реакції, яка переносить пептид з Р-сайту на нову амінокислоту, приєднану до тРНК у цьому сайті. Одначе варто відмітити, що сама пептидил-трансферазна реакція та утворення пептидного зв’язку проходять силами саме 50S-субодиниці.

3. Е-сайт – існує для забезпечення виходу вільної тРНК з малої субодиниці рибосоми.

Сама тРНК не була присутня у перших кристалічних структурах 30S-субодиниці, але РНК з ще однієї малої субодиниці, симетричної до першої, була здатна замінювати тРНК, слугуючи у якості антикодонового стебла/петлі. Таким чином, було виявлено, що тРНК взаємодіє з малою субодиницею рибосоми та відповідною рРНК через:

1. Поверхні малих борозенок за участі деяких рибосомальних білків,

2. Контакти між цукрово-фосфатними кістяками обох молекул.

Цікаво також, що найбільш асоційованим з білками виявився саме Е-сайт, тому тут тРНК зв’язувалася більше з білками, у інших сайтах тРНК мала більше зв’язків саме з рРНК. Таким чином, саме рРНК є основним посередником функціональної активності малої субодиниці рибосоми, а не рибосомні білки.

Визначення тривимірної кристалічної структури повної 30S-субодиниці з включеними антикодоновим стеблом/петлею тРНК та короткою РНК у якості мРНК, що було проведене Огле у 2001 році за 3,3 А, дозволило виявити основні особливості впізнавання кодона антикодоном:

1. Ключову роль у такому впізнаванні відіграють два прилеглі один до одного аденілові нуклеотиди у складі 16S-рРНК, які контактують з малою борозенкою хеліксного кодон/антикодонного стебла у складі тРНК – таким чином виявляється комплементарність перших двох нуклеотидів триплету кодона з антикодоном, а, отже, і вибір правильного кодону.

2. Третя позиція кодону/антикодону, яку називають «коливальною», не залучена до взаємодій з 16S-рРНК, тому антикодон тРНК може допустити існування варіацій водневих зв’язків у районі цієї позиції, вибираючи декілька основ з діапазону можливих.

Взаємодія та впізнавання між кодоном та антикодоном можу бути порушеними за допомогою антибіотику паромоміцину, який також був кристалізований разом з 30S-субодиницею. Серед інших антибіотиками, які інгібують біосинтез білку шляхом приєднання до 30S-субодиниці, та були кристалізовані разом з нею, варто відмітити стрептоміцин. Він міцно зв’язується з чотирма функціональними регіонами 16S-рРНК, в основному, через фосфатні групи останньої. Така взаємодія призводить до стабілізації А-сайту рибосоми у відкритій конформації, таким чином стає можливим зв’язування з цим сайтом сторонніх молекул тРНК, що значно знижує ефективність проофрідингу і призводить до появи помилок біосинтезу білку.

Ще одна кристалічна структура 30S-субодиниці разом з тРНК, отримана за 3,3 А Шланзеном у 2000 році, показала, що регіони рРНК, що прилягають до функціональних сайтів рибосоми, є висококонсервативними. Більше того, зв’язані з А- та Р-сайтом молекули тРНК та кодонова частина зв’язаної з рибосомою мРНК, не взаємодіють з жодним з рибосомних білків, що, знову ж таки, вказує на фундаментальну роль 16S-рРНК у функціонуванні малої субодиниці прокаріотичної рибосоми.

Структура 50S-субодиниці. Беном у 2000 році за 2,4 А було візуалізовано 2711 з повних 2923 нуклеотидів найбільшої з рРНК прокаріот – 23S. Також було виявлено 27 рибосомних білків та 122 нуклеотиди найменшої 5S-РНК. Причому велика субодиниця сягала діаметру у 250 А.

І у випадку 50S-субодиниці білки слугують лише для стабілізації будови нуклеопротеїдної частки та підтримання третинної структури рРНК в ній. Хоча сама рРНК може бути організована у вигляді 6 доменів на основі її вторинної структури, велика субодиниця залишається глобулярною, тому вважається більш конформаційно ригідною, ніж 30S.

Принциповою функцією великої субодиниці є формування пептидних зв’язків, причому активний сайт такої реакції розташований у п’ятому з шести доменів. Точна локалізація активного сайту була проведена кристалографічно з використанням антибіотика пуроміцину, що є інгібітором синтезу білку. Цікаво, що у регіоні біля 18 А навколо такого сайту не виявлено жодної молекули білку, що знову ж таки вказує здійснення каталізу пептидил-трансферазної реакції виключно силами 23S-рРНК, чому їй і приписуються функції рибозимів.

Сама каталізована рибозимом реакція являє собою кислотно/основний переніс водню, ключовим у якому вважається аденін, який приймає на себе атом водню, взятий з аміноацил-тРНК. Такий водень у кінцевому рахунку приєднується до карбонільної групи естерифікованої пептидил-тРНК. Всі нуклеозиди, які залучені до функціонування активного сайту, входять у висококонсервативні послідовності, що вказує на фундаментальність подібного механізму утворення пептидних зв’язків, який діє у процесі еволюції.

Структури цілих рибосом. Як уже згадувалося, у 2005 році Шавіртом була отримана повна кристалічна структура 70S-рибосоми з Е.соli. На основі цих даних було запропоновано два основних плани будови рибосоми, через те, що кристалографічно було виявлено дві незалежні варіанти збирання рибосомальних субодиниць. Є певні відміни у будові цих структур, наприклад, у першій мала субодиниця є оберненою на 6⁰ навколо так званого «шийного» регіону, що поєднує малу та велику субодиниці, коли у другій такого оберту не виявлялося.

Обидві з вищезазначених структур також відрізнялись від отриманої Селмером у 2006 році за 2,8 А кристалічної 70S-рибосоми з бактерії Т. thermophilus, рибосома була кристалізована разом чітко видними тРНК та частиною мРНК, деякі ділянки якої виявилися нерегулярними, тому не візуалізувалися за електронною щільністю (слайди 35-37 (а,b,c) – представлено три проекції 30S-cубодиниці у складі повної рибосоми, сірі регіони – вторинна структура білків, циліндри – кістяки рРНК, палички - основи). Більш детальна будова даної структури представлена на слайді 38 – РНК-компонент малої субодиниці у складі цілої рибосоми (внизу зліва – дві молекули тРНК – вхідна та вихідна), та на слайді 39 – детальний показ регіону взаємодії між антикодоновими стеблами двох молекул тРНК та кодону на фрагменті мРНК, що розташований у правій частині схеми та представлений у витягнутій формі.