Основи структури дуплексних рнк

Структура та конформації подвійного хеліксу РНК. РНК відрізняється від ДНК у двох хімічних аспектах (слайд 9):

1. Цукрові залишки у всіх РНК мають ОН-групу у 2’-положенні, тобто є рибозними,

2. Тимінові основи замінюються на урацилові, які мають той же варіант водневих зв’язків з партнером у парі за умови утворення дуплексу, але не мають метильної групи у 5-положенні.

Ефект, пов’язаний з існуванням додаткової гідроксильної групи до цукру є доволі значним. Він виявляється у тому, що цукри у РНК є набагато жорсткішими у конформаційному плані, і набувають у принципі лише одного типу конформації –С3’-ендо (слайд 9). У іншому випадку ОН-група у 2’-положенні наштовхувалася б на атом С8 пурину або С6 піримідину основи. Такий тип складчастості дуже добре стабілізується.

2’-ОН-група може орієнтуватися лише у декількох дискретних позиціях в результаті взаємодії з атомами О3’ або О4’, або ж доступними акцепторами водневого зв’язку на основі. У хеліксній формі РНК, яку називають канонічною А-РНК, важливою стабілізуючою взаємодією є взаємодія між атомами Н2’ попереднього та О4’ наступного нуклеотиду, який не є доступним для зв’язків з водою.

Одноланцюгові РНК не набувають сильно жорстких конформаційних форм, одначе за певних умов можливе формування антипаралельних подвійно ланцюгових РНК, схожих на дуплекс ДНК. При цьому урацил утворює пару з аденіном, яка є повністю ізоморфною з парою А-Т в ДНК.

Дуплекс РНК є більш жорстким і різко контрастує з поліморфізмом дволанцюгових ДНК, оскільки насьогодні виявлено лише одну форму РНК-дуплексу. Така форма має багато спільного з А-ДНК і має відповідну назву - А-РНК. Конформаційні параметри А-форми РНК були виявлені за допомогою кристалографічних досліджень дуплексних РНК вірусного та синтетичного походження. А-РНК має 11 пар основ на виток, вузьку та глибоку велику борозенку і широку мілку велику, причому пари основ стоять трохи зміщеними по відношенню до вісі хеліксу (слайд 10а та b). Така форма існує у натуральних нитках полінуклеотидів або у полінуклеотидах полі(А)–полі(Т) за умови низької йонної сили. Якщо ж підвищити йонну силу, утворюється підвид А-форми – так звана А’-РНК, яка має 12 пар основ на виток та трохи ширшу велику борозенку. Параметри форм дуплексів РНК представлені у таблиці на слайді 11.

Обидва види хеліксів мають складчастість цукрів С3’-ендо. Ще однією відміною від дуплексів ДНК є те, що, хоча подвійно ланцюгові РНК можуть трохи краще згинатися (у межах до 15⁰), таких згинів у природі майже не відбувається.

Оскільки у чистих дуплексах РНК без появи екстрахеліксних структур практично не відбувається неправильного поєднання основ, сама структура виглядає більш консервативною та регулярною. Через жорсткість структури хеліксу будова таких РНК менше залежить від виду локальних послідовностей, як це спостерігалось у ДНК. Взагалі на сьогодні відкрито лише 2 типи конформацій дуплексної РНК, хоча для одно ланцюгових РНК існує 18 таких типів.

Першим кристалізованим дуплексом РНК були самокомплементарні динуклеозиди р(АУ) та р(ГЦ), отримані у 1976 році незалежно Сіманом та Розенбергом. Таке відкриття показало, що навіть у малих динуклеотидних послідовностях зберігається будова А-РНК та можливе парування за Уотсоном-Криком. Пізніше було кристалізовано октамер структури r(CCCCGGGG), на якому були показані перші канонічні конформаційні параметри А-РНК, а саме – ширина малої борозенки, яка складала 9,7-9,8 А.

Перший повний оберт А-РНК було отримано шляхом кристалізації структури будови r(UUAUAUAUAUAUAA), і знову було виявлено, що така послідовність є класичною А-РНК, та було визначено кут закручування – 33⁰, та довжину однієї пари основ – 2,8 А (слайд 12).

Пізніше у кристалічній формі було отримано дуплекс з послідовністю r(UAAGGAGGUGAU), яка дуже нагадувала додекамер, що потрібен для ініціації трансляції у прокаріот. Такий хелікс у формі А-РНК мав кут закручування 33,3⁰-33,5⁰ та 10,7-10,8 пар основ на один виток.

Довші послідовності хеліксу РНК дуже складно отримати у впорядкованому вигляді, що ілюструється загалом нерегулярним 18-мером РНК, що був отриманий та вивчений на роздільній здатності 1,2 А Клостерманом, Слахом та Стейцом у 1999 році, хоча було виявлено, що і цей варіант мав будову А-РНК. Також певна нерегулярність будови була показана за 1,58 А на 18-мерному дуплексі з послідовністю r(CUG)₆ Муером, Логу та Берглундом у 2005 році. Такий 18-мер має відношення до відомої генетичної хвороби – міотонічної дистрофії. Такий хелікс є майже незміненою А-формою РНК, навіть якщо прийняти до уваги, що він містить шість пар У-У, які не поєднані між собою водневими зв’язками, що змінює значення електростатичного потенціалу у районі малої борозенки.

У 1996 році Еглі, Портманом та Усманом за роздільної здатності 1,8 А на прикладі кристалічної структури дуплекса РНК з послідовністю r(CCCCGGGG) було показано, що бічні сторони основ та фосфатні групи є більш гідратованими, ніж у ДНК. Такий феномен в основному пояснюється існуванням 2’-ОН-груп, 16 з яких у цьому дуплексі мали додаткові 33 водневі зв’язки з молекулами води. Особливо гідратування було наявним у районі малої борозенки та мало наступну структуру - слайд 12 зверху. Взагалі, РНК є більш гідратованою, маючи 21,4 молекул води на кожну пару Г-Ц, у порівнянні з 19,8 молекул для пар Г-Ц у В-ДНК. Це, у свою чергу, призводить до кращої акумуляції контр-йонів, таких як калій та натрій, у малій борозенці РНК-дуплексів у порівнянні з В-ДНК.

Унікальні локальні екстрахеліксні структури РНК. Було виявлено, що дуплексна РНК, хоча і в меншому ступені, ніж ДНК, здатна формувати неправильні пари основ, триплети основ, а також так звані екстрахеліксні регіони. Основними з них є так звані хеліксні петлі або опуклості (слайд 12 внизу), які інтенсивно вивчаються, оскільки є присутніми майже у всіх формах РНК (тРНК, мРНК, рРНК, рибозимах, рибосвітчах) та є, поряд зі стекінгом пар основ, важливим стабілізуючим фактором третинної структури цих форм РНК.

Найбільш відомою з таких петель є так звана тетра-петля складу UUCG, яка здатна формувати стабільну екстрахеліксну структуру навіть у розчині. Пізніше було показано, що з послідовності r(GCUUCGGC)d(_BrU) може формуватися дуплекс з подібними петлями через існування неспарених ділянок Г-У та У-У. Такий хелікс також мав менше 10 пар основ на виток, що вказує на певні неспарені регіони.

Пізніше було виявлено, що додекамер з послідовністю r(GGACUUCGGUCC) також здатен формувати петлі всередині дуплексу через неспарені регіони з основами У-Ц та Г-У. Така структура маж більш широку велику борозенку, ніж у класичній А-РНК, можливо, через взаємодію додаткових молекул води з неспареними основами.

Ще більше відхилення від класики показує послідовність r(GGCCGAAAGGCC), яка формує у центрі хеліксу 4 нестандартні пари основ, що призводить до появи внутрішньої петлі з неспареними основами Г-А та А-А. В результаті утворюється значно скривлена А-форма РНК зі стиснутою великою борозенкою, розширенням малої борозенки до 13,5 А, та явною кривизною всього хеліксу (слайд 13).

Відомо, що найбільш стабільною неканонічною парою основ у дуплексних РНК є Г-У, оскільки вона присутня майже у всіх великих молекулах РНК та має два водневих зв’язки (слайд 13). Таку пару називають «коливальною», оскільки Г у першій позиції кодону може приймати на себе або Ц, або У у якості третього антикодону.

Іншими прикладами екстрахеліксних структур вважаються наступні:

1. «Поцілунковий комплекс» петель, який виявляється у геномі ретровірусу СНІДу HIV-1 у сайті ініціації димеризації, що призначений для сигналів пакування РНК у капсид (слайд 14). Такий комплекс, який походить з послідовності, представленої на тому ж слайді, являє собою дуплекс РНК з двома неканонічними парами А-Г, кожна з яких знаходиться біля неспареного аденозину у петлях. Причому, як було показано Енніфаром у 2001 році, має місце наближення та взаємодія даних петель різних ланцюгів через те, що неспарені основи одного ланцюга взаємодіють через «правильні» пари А-У та Г-Ц екстрахеліксного регіону іншого (слайд 14 внизу), тому даний комплекс і був названий «поцілунковим».

2. 28-мерний гетеродуплекс шпилькової будови, що виявляється на 29-нуклеотидному фрагменті у складі сигнал-розпізнаючої частки (СРЧ). Така структура має неспарені регіони, такі, як, наприклад пуринова опуклість з послідовністю 5’-GGAG/3’-GGAG. Це призводить до зменшення ширини великої борозенки та до локальних недокручених ділянок, що прилягають до «неправильних» пар А-Ц та Г-У.

3. Високоспецифічний сайт зв’язування білку Rev з HIV-1, (RRE) даний сайт є частиною елементу відповіді на даний білок. Після приєднання білку конформація сайту сильно змінюється. RRE, як відомо з кристалографії та ЯМР, являє собою сильно скривлений хелікс через присутність у ньому двох екстрахеліксних основ на одному ланцюзі, аденіну та урацилу, які утворюють опуклість та петлю відповідно, а також через наявність двох неправильних пар пурин-пурин, між якими розташувався неспарений урацил (слайд 15). В результаті кут згинання хеліксу складає біля 30⁰, а велика борозенка значно звужена.

4. Вже згадана нами тетра-петля з послідовністю UUCG, яка характеризується незвичними конформаціями нуклеозидів пари Г-У (син та анти відповідно), існуванням водневого зв’язку між 2’-ОН-групою уридину та атомом О6 гуаніну у цій парі, а також стекінгом цитозину та прилягаючого до нього урацилу (слайд 15а та b).

5. Тетра-петля AGAA, яка входить до родини петель AGNN, її структура була виявлена Ву у 2004 році після приєдання до специфічного домену білку Rnt1. Було виявлено, що саме приєднання здійснювалося через комплементарність розмірів шляхом входження α-хеліксу білка у малу борозенку РНК поблизу тетра-петлі.

6. Псевдо-вузли – є доволі поширеними структурами, особливо у РНК складної будови, рибозимах. Найбільш відомим псевдо-вузловим компонентом є домен РНК-домен теломерази, досліджений за допомогою ЯМР Теймером, Блуа та Фейгоном у 2005 році. Така структура характеризується довгим потрійним хеліксом, який розташований близько до високо консервативної послідовності псевдо-вузлового типу (слайд 16), у цьому регіоні також існує декілька триплетів Хугстіна (слайд 16). Пізніше були охарактеризовані подібні структури з вірусу згортання листків картоплі (Паллан, 2005 рік) та західного жовтого вірусу буряка (Еглі, 2002 рік) за 1,35 А та 1,25 А відповідно.

Взагалі, всі варіанти конфігурацій так званих пар Хугстіна, на прикладі пари Г-А, представлені на слайді 17. Приклад триплету Хугстіна у варіанті Г-Г-А, що також присутній у деяких формах РНК, показаний на слайді 18. Нарешті, у таблиці на слайді 18 зверху зведені дані про кристалізовані на сьогодні структури хеліксної А-РНК, а у таблиці на слайді 19 – структури дуплексної РНК з екстрахеліксними регіонами, які ми розглянули.