Конденсація днк у хроматині еукаріотичних організмів

Загальна характеристика структури хроматину. Еукаріоти мають на декілька порядків більше генетичного матеріалу, ніж віруси та бактерії. Це означає, що ступінь його компактизації повинен бути ще більшим, ніж у даних простіших організмів.

Основною одиницею конденсації геннного матеріалу в організмі еукаріот є, як відомо, хромосома. Наприклад, геном людини складається з 23 гаплоїдних хромосом, що відповідає близько 3,9 10⁹ пар основ. Кожна з хромосом являє собою одиничну молекулу ДНК, що було визначено Кавеноффим та Зіммом у 1973 році за допомогою віскозо-еластичної методики. Таким чином, кожна молекула ДНК у хромосомі людини має у середньому 1,7 10⁸ пар основ, що за довжиною витягнутої ДНК повинно дорівнювати 5,8 см.

До того ж, не потрібно забувати, що хромосоми окрім ДНК містять також багато білку (за масою приблизно одна третина ДНК : дві третини білку). Приблизно 50% даних білків є основними гістонами, решта належить негістоновим білкам, серед яких перше місце займає ДНК-топоізомераза ІІ, що потрібна для конденсації хроматину.

Для того, щоб розміститися у ядрі, ступінь компактизації ДНК повинен становити 10⁴-10⁵ разів. Саме таку ступінь компактності і дає комплекс ДНК з білками – хроматин. Головними відкриттями у структурі хроматину вважаються два:

1. Теорія, запропонована Корнбергом у 1974 році, про те, що хроматин складається з повторюваних одиниць, кожна з яких містить по два комплекти гістонів Н2А, Н2В, Н3 та Н4, а також ділянку ДНК довжиною приблизно 200 пар основ.

2. Електромагнітна візуалізація структури хроматину Олінсом та Олінсом у тому ж таки році, що показала його у вигляді кульок на нитці (буси), таким чином, даючи уявлення про розташування повторюваних ділянок хроматину.

На слайдах 5 та 6 представлено загальну схему компактизації ДНК у хромосоми. Структури нижчого рівня розташовуються у такому порядку:

1. Нуклеосома,

2. Нуклеосомний філамент (10 нм),

3. Хроматинний філамент (30 нм).

Фундаментальною структурною одиницею хроматину є саме нуклеосома – набір з чотирьох пар гістонів різних видів (октамер), навколо якого ДНК закручується приблизно на 2 оберти (1,75). Білкова частина нуклеосоми називається кором або октамером та містить по дві копії корових гістонів Н2А, Н2В, Н3 та Н4 (слайд 5). У всіх вищих еукаріот (але не у дріжджів) існує ще один пістон, Н1, якого називають лінкерним, оскільки він знаходиться назовні нуклеосоми та приєднаний до лінкерної ділянки – ДНК, яка не належить нуклеосомам, але поєднує їх між собою. У еритроцитах птахів функцію Н1, а саме – формування хроматичного філаменту – виконує гістон Н5.

Розщеплення хроматину нуклеазами спочатку дає фракції ДНК, які є кратними ділянкам у 166-246 пар основ, в залежності від організму та типу клітин. Подальша обробка ферментами дає частинки, що називаються хроматосомами, які складаються з однакових ділянок ДНК довжиною по 166 пар основ та повного набору гістонів – однієї копії лінкерного та по дві – корових. ДНК, яка при цьому виявляється окремо короткими ділянками від 1 до 80 пар основ, називається лінкерною, тобто поєднує сусідні нуклеосоми.

Фінальні стадії гідролізу призводять до появи у продуктах частинок нуклеосомного кору, які складаються з 146 пар основ ДНК та октамерного комплексу гістонів. Гістон Н1 при цьому втрачається разом з приєднаною до нього ДНК довжиною 20 пар основ. Нуклеосоми усіх еукаріот є ідентичними за будовою – виявляються у вигляді дисків діаметром 11 нм та висотою 5,7 нм, навколо яких обернено 1,75 обертів ДНК.

За умови низької йонної сили хроматин розгортається і переходить у стан нуклеосомного філаменту, тому і нагадує відомі «буси на нитці», тобто складається з нуклеосом, поєднаних лінкерною ДНК. За умови вищих, фізіологічних концентрацій солей філамент компактизується та переходить у 30 нм хроматинний стан, що являє собою хелікс з 6 нуклеосомами на кожному витку. Посмугованість з періодичністю у 11 нм виявляється вздовж такого 30 нм філаменту – такі проміжки відповідають діаметру нуклеосомного кору, чиї плоскі частини орієнтовані приблизно паралельно (в межах 20⁰) відносно довгої вісі філаменту (слайд 6).

Більш вищі рівні організації хроматину, що виходять за межі хроматичного філаменту, на разі вивчені дуже погано. Це пов’язано з тим, що мітотичні хромосоми, які є найбільш конденсованою формою хроматину, дуже складно піддаються вивченню, оскільки вони є замалими для візуалізації світловою мікроскопією, але завеликі для електромагнітних методів дослідження. До того ж, негістонові білки, які сприяють компактизації хроматину у хромосоми, виявляються у мізерних кількостях порівняно з гістонами, тому їх також важко ізолювати та ідентифікувати.

Домінуючою моделлю вищої організації хроматину, що йде після 30 нм філаменту та була запропонована Ірншоу у 1991 році, є модель організації хроматинних філаментів у петлі по 50-100 тисяч пар основ та прив’язка цих петель до хромосомного кістяку або ядерного матриксу. Такі петлі, як було показано Златановою та Ван-Хольде у 1992 році, не походять з якогось центрального стволу або вісі, а скоріше нерегулярно приєднані до кістяку. Серед білків, які виявляються на даному рівні, варто відмітити наступні:

1. Ламіни А, В та C,

2. Топоізомераза ІІ (основний регулюючий компактизацію фермент, який вносить та знімає так звані супервитки ДНК (слайд 7)),

3. Компоненти цетромери та теломер (теломераза).

Нуклеосомна ДНК та кор. Було виявлено, що ДНК розташована виключно назовні нуклеосоми, де робить 1,75 обертів навколо останньої у ліву сторону майже симметрично до центральної вісі нуклеосоми.

Кристалографічні дослідження з роздільною здатністю 7 А показують, що ДНК у складі нуклеосоми має майже правильну В-форму з кроком спіралі 28 А. ДНК навколо кору не є постійно та помірно зігнутою, скоріше демонструє різкі згини та перегини на кожні 1-4 витки спіралі. Такі згини можуть пояснюватись існуванням контактів ДНК з гістоном Н3 та/або з певними послідовностями самої ДНК. Кристалографія показує, що у складі кору гістони розташовуються у наступному порядку:

Н2А-Н2В : Н3-Н4 : Н3-Н4 : Н2А-Н2В

Центральна ділянка нуклеосомної ДНК (приблизно 80 пар основ) взаємодіє з тетраметом (Н3-Н4)₂. Подібний комплекс ДНК-білок має двовимірну симетрію. Ті ділянки ДНК в 20 пар основ з кожного боку центрального регіону взаємодіють в основному з кожним з гетеродимерів Н2А-Н2В.

Як ми вже розглядали, В-форма ДНК у розчині має 10,5 пар основ на виток. ДНК у складі нуклеосоми має лише 10 пар основ на виток біля кінців нуклеосомальної ДНК, але приблизно 10,7 на ділянці біля центру. Таким чином, середнє значення складає 10,2 пар основ на виток для ДНК нуклеосом. Такий факт може пояснювати, принаймні частково, так званий «лінкерний парадокс», згідно якого нуклеосомна ДНК повинна мати 1,75 витків навколо кору, але у релаксованих формах хроматину виявляється лише 1 виток.

Дослідження за роздільної здатності 3,1 А показали, що гістоновий октамер є структурою з трьох частин – центральним тетрамером (Н3-Н4)2, що франкований на відповідних кінцях двома димерами Н2А-Н2В. Діаметр такого октамеру складає 65 А, а довжина – від 10 до 60 А. Таким чином, в залежності від орієнтації, за формою це може бути або плоский диск, або щось схоже на кілок.

Всі гістони у складі кору мають подібну тривимірну структуру – являють собою витягнуті молекули з центральним довгим хеліксом, що на кожному кінці оточений петлею та коротшою спіраллю. Така структура отримала назву «гістоно-згорнутої». Пари гістонів Н3-Н4 та Н2А-Н2В з кожного боку дуже точно та специфічно поєднуються між собою ділянками «потискання рук». На поверхні октамеру такий суперхелікс з димерів білків має спіральне розташування компонентів.

Всі корові гістони мають дві частини:

1. Глобулярний домен,

2. Заряджений хвостовий домен з великою кількістю лізину та аргініну.

На хвостах, як правило, здійснюється велика кількість пост трансляційних модифікацій, таких як ацетилування або фосфорилювання. Організація закручування ДНК навколо кору лежить саме на глобулярному домені корових гістонів, окрім Н4, у якому саме ці домени приймають участь у позиціонуванні ДНК відносно кору та приєднанні даної молекули до останнього.

Основними силами, які забезпечують збереження структури нуклеосоми, вважаються електростатичні взаємодії між фосфатів у складі ДНК з аргінінами глобулярних регіонів корових гістонів, особливо пари Н3-Н4. Дана пара білків має чи не найбільш консервативну будову серед усіх відомих на сьогодні білкових молекул. На кристалічних структурах кору присутні лише 70% амінокислотних залишків гістонів, припускається, що решта, яка розміщена на аміно- або карбокси-термінальних ділянках Н2А, має нерегулярну структуру, тому і не виявляється.

Гістони можливо від’єднати від ДНК високою концентрацією солі, оскільки основними силами приєднання є електростатичні. За таких умов спершу дисоціює Н2А та Н2В, пізніше – Н3 та Н4. Це іще раз доводить, що останні існують у вигляді саме тетрамеру. Причому димери Н2А-Н2В слугують у якості утримувачів подальшої олігомеризації Н3-Н4. Виявлено також, що за фізіологічних умов час дисоціації димерів від октамеру складає менше 1 секунди.

Лінкерні гістони та ДНК. У 1978 році Сімпсоном шляхом м’якого розщеплення нуклеазами було виділено комплекс з корового октамеру гістонів, однієї молекули Н1 та ділянки ДНК приблизно у 160 пар основ довжиною – це все він назвав хроматосомою. Дослідження з термічної денатурації показали, що Н1 був здатен стабілізувати та взаємодіяти не лише з лінкерною, але й з коровою ДНК. Причому кінці ДНК у хроматосомі на вході та на виході з хроматосоми, були розміщені під кутом у 50-60⁰ відносно вісі нуклеосоми, саме на цих двох ділянках (входу-виходу) і локалізувався гістон Н1, що призводило до перекривання цих ділянок між собою

Молекула Н1 має:

1. Центральний глобулярний домен, який контактує з ДНК та захищає її від дії нуклеаз,

2. Подовжені домени – так звані «руки» - на N- та C-кінцях, які, можливо, взаємодіють з лінкерною ДНК та мають дуже високе значення позитивного заряду. Такі домени, як вважається, потрібні для конденсації хроматину, тому що вони містять численні сайти фосфрилювання, що корелює з подіями клітинного циклу. Вважається, що під час взаємодії з ДНК, дані «руки» знаходяться у формі α-хеліксу та лягають у велику борозенку молекули.

Варіант лінкерного гістону, Н5, який іноді називають GH5, було вивчено з роздільною здатністю 2,5 А. Виявлено, що він являє собою комплекс з трьох хеліксів з вбудованим β-вигином на С-кінці, який межує з хеліксним кором. Така структура дуже нагадує будову транскрипційного фактора HNF-3γ – даний білок має два «крила» для взаємодії з ДНК, та ще один взаємодіючий хелікс посередині. Одне з даних «крил» відповідає «руці» на N-кінці Н5, інше – С-кінцевій «руці», яка має нерегулярну структуру у Н5.

Вольффе у 1993 році виявлено, що обидва типи лінкерних гістонів приєднуються переважно до нуклеосомальної ДНК, асоційованої з октамером, ніж до лінійної дуплексної чистої ДНК. Для такого приєднання необхідна присутність вільної лінкерної ДНК на обох сторонах кору. Приєднання однієї молекули Н1 до кору захищає 20 додаткових пар основ від дії мікрококової нуклеази, з них 15 пар основ знаходяться на одній стороні кору, та 5 пар основ – на іншій. Було показано, що нуклеосома має на одному з боків специфічний сайт, де існує особливо міцне приєднання Н5, тут же приєднуються й корові гістони. Н5 здатен при цьому змінювати спорідненість корових гістонів до даної ділянки.

Розміщення (позиціонування) нуклеосом. Згортання ДНК у хроматин найчастіше асоціюють зі зменшенням доступності самої ДНК. Одначе, лінкерна ДНК у даному випадку є більш доступною для дії мікрококової нуклеази, ніж корова (нуклеосомна) ДНК. Таким чином, для правильного приєднання транскрипційних факторів та регуляції загальної активності генів нуклеосоми у хроматині повинні бути розміщені певним правильним чином у всіх хромосомах певного виду організмів. Таке позиціонування має дві основні форми:

1. Трансляційне – визначається довжиною ділянки контакту ДНК з нуклеосомою між початком та кінцем самого контакту.

2. Обертальне – визначається орієнтацією поверхні ДНК по відношенню до гістонового кору.

Особливо явне позиціонування нуклеосом характерне для генів 5S-рРНК. Така ДНК має періодичну зміну у ширині малої борозенки, яка відбувається раз на кожен оберт спіралі. Виявлено, що дана зміна зберігається після приєднання ДНК до нуклеосоми.

Взагалі, подібні варіації у ширині малої борозенки, що за періодичністю співпадають з хеліксним повтором, призводять до зкривлення ДНК. Вузькі ділянки малої борозенки будуть згинати ДНК у сторону гістонового кору, а широкі – від нього, що повинно зменшити енергетичний кошт згортання ДНК навколо октамеру. Дана гіпотеза була підтверджена з використанням синтетичних послідовностей ДНК, у яких сегменти з трьох основ одного виду були розділені двома парами інших основ та повторювались кожні 10 пар. Такі послідовності навіть краще, ніж природні, згорталися навколо нуклеосоми, хоча різниця у вільній енергії такого згортання була невеличкою.

Виявлено, що певні як трансляційне, так і обертальне позиціонування у нуклеосомах зберігалися у діапазоні температур від 0 до 70⁰ та концентрацією солі від 0 до 0,8 М, що свідчить про достатньо значні за силою та енергією взаємодії, які тримають нуклеосоми та ДНК навколо них у певній орієнтації. Було також виявлено, що у формуванні підтриманні даного позиціонування відіграють роль також і певні білки, які пов’язані з хроматином.

Вплив нуклеосом на транскрипцію. Раніше вважалося, що компактизація ДНК у хроматин та її зв’язки з гістонами призводять до зменшення доступності молекули для ферментів і транскрипційних факторів, та, внаслідок цього, до інгібування процесів транскрипції та реплікації. Одначе пізніше було доведено, що це абсолютно не так. Виявилося, що і транскприція, і реплікація можуть спокійно проходити у нуклеосомальній ДНК, одначе ініціація цих процесів все-таки дещо уповільнюється.

Доступ транскрипційних факторів та ферментів до ДНК визначається саме видом згортання останньої навколо нуклеосом та позиціонуванням нуклеосом. Тобто, регуляція активності геному (активація або репресія генів) визначається не лише самими послідовностями та факторами, а також і типом згортання ДНК у нуклеосомах:

1. Транскрипційні фактори, в основному, приєднуються до вільних доступних ділянок ДНК – лінкерних або орієнтованих у бік середовища у позиціонованих нуклеосомах. Ті ж ділянки, які розміщені всередині нуклеосоми та орієнтовані в сторону кору, скоріше за все, піддадуться репресії.

2. Оскільки у певним чином позиціонованих нуклеосомах існують добре визначені контакти між ДНК та гістонами, пост трансляційні модифікації або дисоціації даних білків можуть модулювати доступ факторів до ДНК без необхідності руйнувати всю нуклеосому. Прикладом може слугувати взаємодія транскрипційного фактора TFIIIA з геном 5S-рРНК. Лужні N-кінцеві хвости корових гістонів лежать у великій борозенці ДНК і, таким чином, заважають приєднанню фактора. Якщо ж хвости гістонів піддаються ацетилуванню, їх взаємодія з ДНК послаблюється, що дозволяє фактору TFIIIA приєднатись до ДНК. Також виявлено, що даний фактор конкурує за місце приєднання з димером Н2А-Н2В, оскільки від’єднання даного димеру призводило до активації генів рРНК. Такий же ефект спостерігається у випадку фосфорилювання кінцевих хвостів Н1 та Н2В або заміни Н1 іншими регуляторними білками.

3. Існування одного з двох неповних витків ДНК навколо нуклеосоми формує петлі, які можуть зближувати між собою приєднані до них регуляторні елементи. Наприклад, два елементи рекогніції у складі глюкокортикоїдного рецептора у довгому термінальному повторі гену вірусу пухлин молочної залози мишей розділені між собою ділянкою у 92 пари основ. Це відбувається за рахунок закручування ДНК навколо октамеру, тому дані ділянки знаходяться набагато ближче одна відносно одної і можуть кооперативно приєднуватись до димеру рецептора. Якщо ж дані ділянки знаходилися б у лінкері, відстань між ними становила б не менше 160 пар основ.

Таким чином, основними факторами регуляції активності хроматину є не лише транскрипційні фактори та послідовності ДНК, а також і позиціонування ДНК навколо нуклеосоми, поведінка гістонів та згортання і стан хроматину. Всі ці фактори тісно пов’язані між собою.

Основним питанням, яке стосується транскрипції ДНК еукаріот in vivо є питання щодо того, чи залишається ДНК під час транскрипції приєднаною до гістонів, чи вони від’єднуються напочатку та приєднуються організовано або випадково після здійснення процесу. Виявлено, що принаймні ступінь спіралізації ДНК під час транскрипції змінюється, що викликається зміщенням гістонів та проходженням транскрипційного комплексу РНК-полімерази. Було також встановлено, що, хоча значного впливу напрямку суперспіралізації на компактизацію хроматину не відбувається, гістони краще приєднуються до негативних, ніж до позитивних супервитків, оскільки воно пов’язане з меншими витратами енергії, а саме приєднання гістонів до ДНК індукує появу позитивних супервитків.

Оскільки встановлено, що РНК-полімераза продукує позитивні супервитки попереду транскрипційного комплексу та негативні – позаду, приєднання октамеру до ДНК під час транскрипції повинно дестабілізуватися саме попереду комплексу. Причому, можливо, така дестабілізація включає у себе від’єднання гістонового кору та перенесення на найближчу ділянку акцепторної ДНК. У системі in vitro була показана можливість такого «перескоку» октамерів через полімеразу без вивільнення зі складу хроматину – ДНК попереду полімерази розкручується з октамеру, в той час як ДНК позаду вже закручується навколо нього.

Також показана можливість від’єднання октамерів від ДНК під впливом транскрипційних факторів, наприклад, додаванням до середовища з нуклеосомами ДНК-зв’язуючого домену білку GAL4 з дріжджів. Утворений третинний комплекс, що складався з GAL4-AH, корових пістонних білків та ДНК, був нестабільним у присутності неспецифічної конкурентної ДНК, змінюючи форму то на оригінальний хроматин з ДНК та гістонами, то на чисту ДНК з приєднаним до неї GAL4. Було виявлено, що N-кінці гістонів здатні інгібувати приєднання GAL4-АН, особливо до ДНК у центрі нуклеосомного кору, причому приєднання наступних молекул даного фактора відбувалося кооперативно з кінців нуклеосоми.

Виявлено також, що N-кінці корових гістонів здатні також впливати на репресію транскрипції через лінкерний гістон Н1. Сама молекула Н1 здатна репресувати дію транскрипційного фактора USF, але майже зовсім не діє на GAL4-АН. Ацетилювання або від’єднання аміно-термінальних ділянок Н1 призводило до часткової та повної втрати інгібуючого впливу Н1 на USF.

Зв’язування транскрипційних факторів з нуклеосомою може бути стимульоване також за допомогою специфічного білка, що приєднується до гістонів – нуклеоплазміну. У присутності GAL4-АН, що містить домени зв’язування з ДНК та димеризації, нуклеоплазмін відщеплює Н2А та Н2В від нуклеосоми. Це у подальшому полегшує обмін тетрамерами (Н3-Н4)2 з конкуруючою ДНК.

Один з постульованих механізмів транскрипції за участю гістонів та білків високої мобільності (HMG) представлено на слайді 8. За цією схемою хроматинна фібрила локально розкручується, при цьому неактивні нуклеосоми з гістоном Н1 вивільнюються. На місце гістонів Н1 приєднуються білки HMG, після чого нуклеосоми розвертаються, причому всі корові гістони залишаються зв’язаними з ДНК. Ланцюги ДНК у даних ділянках тимчасово розходяться. Некодуючий ланцюг ДНК у цей час зберігає нуклеосоми у згорнутому вигляді з приєднаними до них білками HMG. Кодуючий ланцюг з розгорнутими нуклеосомами транскрибується полімеразним комплексом.

Хроматинний філамент. Саме у його вигляді підтримується структурна цілісність хроматину упродовж більшої частини клітинного циклу. Утворення даного філаменту залежить від зовнішніх умов:

1. За низької йонної сили розчину виявляється зигзагоподібна нитка з варіантом будови «бус на ниточці»,

2. За середньої концентрації солі хроматин набуває форми плоскої стрічки шириною приблизно 25 нм,

3. За 0,1 М NaCl, що є близьким до фізіологічних умов, виявляється 30 нм нитка з посмугованістю в 11 нм.

Згортання ДНК у 30 нм філамент є постійним поступовим процесом, а не різким переходом між станами. Конденсація може відбутись за умови присутності значних концентрацій солей через екранування зарядів ДНК моновалентними катіонами, та шляхом зниження ефективного заряду лінкерної ДНК через контройонну конденсацію мультивалентними катіонами.

Виявлено, що гістони Н1 та Н5 відіграють значну роль у конденсації ДНК до стану хроматинної фібрили, хоча і не є необхідними для неї, їх присутність, наприклад, може дозволити дещо знизити концентрацію солі у середовищі. Виявлено однак, що за умови присутності лінкерних гістонів компактизація йде швидше та більш впорядковано.

Існує декілька моделей згортання гістонів та ДНК у хроматинну фібрилу. Найбільш відомою з них є соленоїдна модель з шістьма нуклеотидами на виток та кроком спіралі у 11 нм. Оскільки ширина нуклеосомного диску також складає 11 нм, можна припустити, що у даній моделі нуклеосоми розташовуються у вигляді стосиків, довгі вісі яких йдуть паралельно вісі нитки. Згортання хроматину у 30 нм фібрилу стабілізується кооперативними взаємодіями між лінкерними гістонами, що розташовуються ближче до середини нитки.

Недоліком соленоїдної моделі є невизначеність щодо розташування та стану лінкерної ДНК. Тому була запропонована уточнююча модель «згорнутого лінкера». За нею лінкерні ділянки ДНК є у свою чергу згорнутими між сусідніми нуклеосомами. Це співвідноситься з даними щодо варіабельності діаметру хроматинної нитки в залежності від довжини лінкера – у видів з довгими лінкерними ДНК такий діаметр є більшим. Також з досліджень Яо та інших у 1991 році відомо, що короткі лінкерні ДНК у динуклеосомах є достатньо гнучкими за умов, що сприяють стабілізації згорнутого хроматину.