- •Глава 5. Липиды
- •5.1. Общая характеристика и классификация липидов
- •5.2. Липидные мономеры
- •2. Высшие алифатические спирты, альдегиды, кетоны.
- •5.3. Многокомпонентные липиды
- •5.4. Биологические функции липидов
- •Глава 6. Ферменты
- •6.2. Химическая природа и структура ферментов
- •6.3. Кофакторы ферментов Ионы металлов как кофакторы ферментов
- •Коферменты
- •6.4. Механизм действия ферментов
- •6.5. Свойства ферментов
- •6.6. Специфичность действия ферментов
- •6.7. Факторы, влияющие на скорость ферментативного катализа
- •Влияние температуры на активность ферментов
- •Влияние рН на активность ферментов
- •Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции
- •Зависимость скорости реакции от времени
- •6.8. Регуляция активности ферментов
- •Активация ферментов
- •Ингибирование ферментов
- •Аллостерическая регуляций действия ферментов
- •6.9. Определение активности ферментов
- •6.10. Номенклатура и классификация ферментов
- •6.11. Локализация ферментов в организме и клетке
- •6.12. Применение ферментов
Аллостерическая регуляций действия ферментов
Многие ферменты с четвертичной структурой могут обратимо связывать по месту аллостерического (регуляторного) центра некоторые вещества, активирующие или ингибирующие фермент. Эти вещества называют аллостерическими эффекторами, в качестве которых могут выступать различные метаболиты, гормоны, ионы металлов, коферменты и очень редко - молекулы субстрата. Аллостерический ингибитор, комплементарно соединяясь с регуляторным центром, меняет его конформацию, что влечет за собой изменение конформации и каталитического участка (активного центра). Аллостерический активатор, напротив, облегчает превращение субстрата в активном центре фермента.
В качестве примера аллостерической регуляции рассмотрим обратимое инактивирование фермента аденилатциклазы, катализирующей реакцию синтеза циклоаденозинмонофосфата (цАМФ) из АТФ по схеме:
АТФ → цАМФ + Н4Р2О7
Эта реакция играет важную роль в системе регуляции передачи физиологического сигнала из внеклеточной среды внутрь клетки. Аллостерическими эффекторами аденилатциклазы являются некоторые гормоны (адреналин, глюкагон и др.). Аденилатциклаза локализуется в плазматической мембране и состоит из трех субъединиц: рецептора гормона, ГТФ-связывающего белка и каталитической субъединицы. Рецептор, гормона ориентирован центром связывания на наружную поверхность мембраны, а каталитическая субъединица своим активным центром выходит на внутреннюю сторону мембраны (рис.20).
Рис. 20. Регуляция действия аденилатциклазы: Р - рецептор гормона;
Г- ГТФ-связывающий белок; А- каталитическая субъединица аденилатциклазы
Когда рецептор гормона свободен, ГТФ-связывающий белок, соединен с ГДФ, и в этом состоянии системы аденилатциклаза неактивна. Когда к рецептору присоединяется гормон ГДФ в белке заменяется на ГТФ, и этот новый комплекс «ГТФ-белок» активирует аденилатциклазу - начинается синтез цАМФ, активирующего другие ферменты внутри клетки. Таким образом, гормон - первый и внешний, а цАМФ - второй и внутриклеточный вестник сигнала. Активная аденилатциклаза усиливает, например, распад гликогена (см. главу 10) и подавляет его синтез, вызывает расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и т.д.
6.9. Определение активности ферментов
В основе всех методов определения активности ферментов лежит положение, согласно которому активность ферментов определяется количеством превращенного субстрата при определенных стандартных условиях: концентрации субстрата, температуре и рН среды. При определении активности фермента следует не забывать о том, что она резко меняется при различных условиях реакции. Различные методы количественного определения активности ферментов основаны на следующих принципах:
1) определяется наименьшее количество ферментного препарата, способного за определенный промежуток времени и при определенных условиях расщепить требуемое количество субстрата;
2) определяется остаток субстрата после воздействия фермента и затем рассчитывается количество субстрата, расщепившегося под действием определенного количества фермента;
3) активность фермента обозначают по времени, в течение которого определенная навеска фермента катализирует превращение определенной доли субстрата в стандартных условиях (начальная концентрация субстрата, температура, рН среды).
Согласно правилам, рекомендованным в 1961 году Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, за единицу фермента (Е) принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль вещества (субстрата) за 1 минуту. Число единиц фермента в тканях определяют по формуле:
Часто находят удельную активность фермента: она равна числу единиц фермента в образце, деленному на массу белка (в мг) в этом образце. Например, если в 1 грамме ткани печени содержится 140 единиц лактатдегидрогеназы и 200 мг белка, то удельная активность лактатдегидрогеназы в печени равна 140/200=0,7 (мкмоль/мин)/мг. Если имеется очищенный индивидуальный фермент, то можно измерить его молярную активность: она равна числу единиц фермента в образце, деленному на количество фермента в микромолях. Молярная активность указывает, сколько молекул субстрата превращается одной молекулой фермента за 1 минуту.
Для правильного определения активности фермента необходимо проводить его в стандартных условиях, которые устанавливаются для каждого фермента из предварительных кинетических исследований, и точно измерять изменение содержания субстрата или продукта реакции за определенный, отрезок времени.
Рекомендуется проводить определение активности фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения.