Технология «сухой химии»
Ферментативные реагенты применяются также и в «сухой химии». Под «сухой химией» понимается процедура нанесения на бумагу или плёнку в определённых пропорциях необходимых для химического анализа реагентов, которые затем высушиваются и стабилизируются. На технологических приемах «сухой химии» основано использование диагностических полосок (Рис.5). Все необходимые компоненты для реакции (буферный раствор, индикатор, ферменты, субстрат и другие компоненты) нанесены на бумажную или пленочную основу (реагентная матрица).
Рис. 5. Устройство индикаторной тест-полоски. (http://www.terramedica.spb.ru)
После введения точного образца крови, сыворотки или плазмы реагенты вновь активируются и химическая реакция протекает также, как и в «жидкой» химии. Далее сравнивают визуально интенсивность окраски аналитической зоны тест-полоски с окраской зон шкалы и определяют результат. Изменения окраски продуктов реакции также регистрируют с помощью отражательного фотометра (рефлотрона).
В основе определении глюкозы в моче с помощью диагностических тест-полосок (ГлюкоФан, Диафан, Уриглюк, Диаглюк, Глюкотест) методом «сухой химии» также лежит ферментативная реакция (глюкозооксидаза/пероксидаза).
Иммуноферментный анализ
В основе иммуноферментного метода лежит специфическое «узнавание» анализируемого вещества специфическим к нему антителом. Использование ферментов в иммуноферментном анализе заключается в том, что молекула фермента, соединённая с антигеном или антителом, служит индикатором реакции антиген-антитело в среде. Измеряя активность фермента, можно оценить, сколько молекул антигена вступило в иммунохимическую реакцию с антителом.
Антитела — белки сыворотки крови, синтезирующиеся в ответ на появление чужеродного вещества (антигена). Антигеном является химический или биологический объект, против которого могут быть получены антитела. Роль антигенов могут играть низкомолекулярные вещества, а также белки, нуклеиновые кислоты, вирусы, микроорганизмы. Для получения антител используются различные виды животных: кролики, мыши, морские свинки, овцы, лошади. Инъекции антигена, осуществляемые в присутствии стимуляторов иммунного ответа, приводят к накоплению в сыворотке крови специфических антител. Антитела могут быть выделены в виде -глобулиновой фракции путем осаждения спиртом, полиэтиленгликолем или сульфатом аммония. Очистку антител осуществляют с помощью ионообменной хроматографии, а также аффинной хроматографии на иммуносорбентах.
Одним из путей визуализации образования комплекса антиген-антитело является использование меченых соединений, в которых метка может легко определяться в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого вещества. В иммуноферментном анализе в качестве такой метки индикации используют ферменты, наиболее широко пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу из кишечника телят и E.coli (Рис. 6). Возможность применения ферментов в качестве метки в иммунном анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитической активностью, позволяющей с применением соответствующих субстратов регистрировать ферменты в растворе на уровне 10-15 М и ниже. Ферменты связанны ковалентно с антителами и при добавлении в систему соответствующих субстратов (хромогенные субстраты) катализируют образование окрашенных продуктов. Среди хромогенных субстратов для пероксидазы наибольшее распространение получили о-фенилендиамин и 3,3/,5,5/-тетраметилбензидин.
В качестве примера иммуноферментного анализа (ИФА, или ELISA, от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) приведем схему твердофазного одностадийного «sandwich»-варианта иммуноферментного анализа на планшетах определения тропонина I («Вектор-Бест», Россия) позволяющего определить содержание как антител, так и антигенов (Рис. 6).
Рис. 6. Антиген (АГ) добавляют к иммобилизованным на носителе антителам (АТ), промывают с целью удаления несвязанных молекул антигена и добавляют антитела, коньюгированные с ферментом (АТ-пероксидаза хрена). После второй промывания добавляют хромогенный субстрат (тетраметилбензидин, ТМБ) и далее оценивают содержание окрашенного продукта ферментативной реакции (инструкция к набору реагентов для иммуноферментного определения концентрации тропонина I в сыворотке крови человека, «Вектор-Бест»).
К настоящему времени разработано большое число различных вариантов проведения иммуноферментного анализа, имеющих как принципиальные отличия, так и второстепенные. Обычно методы иммуноферментного анализа различают по принципу проведения всех стадий анализа – с участием твердой фазы (гетерогенные методы) или же только в растворе (гомогенные методы).
Методы иммуноферментного анализа применимы для контроля лекарственной терапии, препаратов, влияющих на сердечнососудистую систему, антибиотиков, барбитуратов, кодеина, морфина. Эти методы позволяют выявлять наличие психотропных препаратов в организме, наркотиков. Иммуноферментный анализ используется в контроле биотехнологических процессов и качества лекарственных препаратов. Так, в микробиологических производствах иммуноферментный анализ может применяться для выявления высокоэффективных микроорганизмов — продуцентов биологически активных веществ (антибиотиков, ферментов и т.д.). Иммуноферментный анализ может также использоваться для контроля появления посторонних микроорганизмов, бактериофагов в ферментерах. Иммуноферментный анализ применим для определения содержания гормонов, белков и метаболитов (тиреотропный гормон, тироксин, тиреоглобулин, кортизол, прогестерон, тестостерон, фибронектин, -фетопротеин, тропонин I, неоптерин, иммуноглобулины, фолиевая кислота, витамин В12 и др.), для выявления возбудителей инфекций (хламидиоз, микоплазмоз, герпес, гепатиты А, В и С, кандидоз, цитомегаловирус, краснуха, сифилис, ВИЧ, и др.), паразитов (описторхоз, лямблиоз), а также для контроля лекарственной терапии (антибиотики, барбитураты, кодеин, морфин).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Современные достижения биохимии позволяют понять молекулярные основы жизнедеятельности, прояснив механизмы наследственности, биоэнергетики, обмена веществ, регуляции и адаптации биохимических процессов в организме.
Ориентация фундаментальных знаний в прикладном направлении служит основой профилизации курса биохимии в вузах. В соответствии с этим при освоения биохимии ставится следующая цель – научить Вас применять при изучении последующих дисциплин и при профессиональной деятельности сведения о химическом составе живых организмов, биологической роли молекулярных процессов жизнедеятельности организма человека как при физиологических условиях, так и при патологических.
Освоение темы «Ферменты» позволит Вам уметь трактовать данные энзимологических исследований сыворотки крови, владеть понятием ограничения в достоверности и специфики наиболее часто встречающихся энзимологических тестов, владеть навыками постановки предварительного диагноза на основании результатов биохимических исследований жидкостей человека.
Список сокращений
АЛТ - аланинаминотрансфераза
АСТ – аспартатаминотрансфераза
ГГТ – гамма-глутаминтрансфераза
ГлутаматДГ – глутаматдегидрогеназа
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
КК – креатинкиназа
КК-MB (CK-MB) – изофермент креатинкиназы MB
ЛДГ – лактатдегидрогеназа
НАД – никотинамиддинуклеотид
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
РНК – рибонуклеиновая кислота
ФАД – флавинадениндинуклеотид
ФМН – флавинмононуклеотид
АТФ – аденозинтрифосфат
Myo – миоглобин
CTnI – тропонин I сердца
CTnT – тропонин T сердца
Рекомендуемая литература
Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. Кн. 7. Сер. «Биотехнология».-М.: Высш. шк., 1987.-159с.
Биосенсоры // Итоги науки и техники. Сер. «Биотехнология».- М.: ВИНИТИ, 1990.-Т.26.
Биохимические основы патологических процессов: Учеб. пособие / Под. Ред. Е.С. Северина.- М.: Медицина, 2000.
Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т.-Мн.: Беларусь, 2000.-958 с.
Маршал В.Д. Клиническая биохимия. Пер с англ.-СПб.: Издательство «Бином-Невский диалект»-2000.-368 с.
Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных ис-следований..- М.: Медицина, 2000.-554 с.
Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник / под редакцией профессора А.И. Карпищенко, С.-Петербург, Интермедика, 2001.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер.с англ.- М.: Мир, 2002.-589с., ил.
Клиническая биохимия / Под. ред. В.А. Ткачука. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002.- (Серия «XXI век»). – 360 с.
Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородний И.В. Клиническая биохимия (Учебное пособие для студентов медицинских вузов).- М.: Триада-X, 2002.
Лифщиц В.М., Сидельников В.И. Лабораторные тесты у здоровых людей (референтные пределы): Справочник. – М.: Триада-X, 2004.
Норма в медицинской практике: Справочное пособие. – М.: МЕДпресс-информ, 2004. – 144 с.
Яковлева Г.Е. Ферменты в клинической практике. – Новосибирск: «Вектор-Бест», 2005. – 44 с. (http://www.vector-best.ru)
Клиническая лабораторная диагностика. 2-е изд.: Медведев В.В., Волчек Ю.З. Спб. Гиппократ, 2006 г. - 360 с.
Кишкун А.А. Руководство по методам лабораторной диагностики. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 822 с.
Старостина В.К., Дегтева С.А. Холинэстераза: методы анализа и диагностическое значение. – Новосибирск: «Вектор-Бест», 2008. 35 с. (http://www.vector-best.ru)
Интернет-ресурсы
http://www.invitro.ru
http://www.chem.qmul.ac.uk
http://www.medlit.ru/
http://www.vector-best.ru/
http://www.biokhimija.ru
Приложение 1