2. Строение и биологическая роль катализа

Каталаза - фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: 2Н2О22Н2О + О2, обеспечивая тем самым эффективную защиту клеточных структур от разрушения под действием Н2О2 [Error: Reference source not found]. Кроме реакции разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород, каталаза слабо катализирует также окисление перекисями различных спиртов и других соединений.

Каталаза относится к гемсодержащим ферментам. Ее молекулярный вес превышает 225 тыс. В живых организмах существует несколько изоэнзимов каталазы. Каталаза широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека, растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует у некоторых анаэробных микроорганизмов) [Error: Reference source not found]. Внутри клетки каталаза сосредоточена в различных структурах. По данным Дюве в ядре, тяжелых и легких митохондриях, микросомах, в некоторых пероксисомах и т.д.

Функционально каталаза – тетрамер, состоящий из 4 идентичных субъединиц, сложенных таким образом, что N-концевой участок полипептидной цепи каждой субъединицы проходит сквозь петлю, связывающую гемсодержащий домен одной субъединицы с доменом, включающим спиральный участок соседней.

Рис.1.1. Активный центр каталазы Penicillium vitale с двумя молекулами воды, включающий гем (плоская группа в центре рисунка), аминокислотные остатки гистидина и аспарагина (вверху), и аминокислотные остатки тирозина и аргинина (внизу).

Гем состоит из протопорфиринового кольца и центрального атома железа. Протопорфириновое кольцо образовано четырьмя пирольными кольцами, связанными метиленовыми мостиками.

Внутри молекулы имеются значительного размера каналы и полости (самая большая радиусом ~7 A) [Error: Reference source not found, Error: Reference source not found]. Полости не сообщаются с поверхностью молекулы и обеспечивают, видимо, диффузию субстрата к реакционному центру. Два канала, главный и минорный, подходят к дистальной полости, где размещаются субстрат, продукты реакции или ингибитор. Главный канал (длина 30 A, сечение на поверхности молекулы 15 A) имеет форму конуса, сужаясь при приближении к месту реакции, так что доступ к гему для больших молекул ограничен, а для пероксида водорода - свободен. Внутренняя поверхность каналов выложена гидрофобными остатками.

Зная строение активного центра (рис.1.1) и способ встраивания в него субстрата, можно понять механизм катализа (реакция впервые была предложена Чансом):

где - нативная каталаза в покоящемся состоянии, т.е. в присутствии воздуха и воды и в отсутствие перекиси водорода, - Комплекс I каталазы.

Гемсодержащие каталазы имеют свою, уникальную пространственную организацию, неизменную в течение эволюции. Во всех изученных гемовых каталазах укладка полипептидной цепи одинаковая, названная каталазным типом свертывания. С другой стороны, из сравнения гемоглобинов и каталаз видно, насколько свойства гема зависят от природы белковой глобулы: гем в разных белках выполняет разные функции.

Существуют каталазы, построенные из совершенно других цепей аминокислот и имеющие иной активный центр, в который входят два атома марганца, но отсутствует гемовая группа. Пространственную структуру димарганцевой Т каталазы из термофильной бактерии Тhermus thermophilus определили в лаборатории Б.К.Вайнштейна в 1986-2000 гг. последовательно, при разрешении 3 и 1.0 A. Ее молекула (молекулярная масса 200 кДа) состоит из шести идентичных субъединиц, образующих гексамер. Анализ структуры области активного центра позволил предложить механизм расщепления перекиси водорода [Error: Reference source not found]. Несмотря на разительные отличия в структуре, обе описанные каталазы выполняют одну и ту же функцию.

Каждый вид, по-видимому, синтезирует свой собственный фермент, отличный от других, однако ферменты, выделенные из различных частей одного и того же организма, иммунологически неразличимы [Error: Reference source not found]. Отдельные субъединицы каталазы, у которых природа аксиального лиганда, вероятно, остается неизменной, обнаруживают пероксидазную активность.

Было установлено, что фермент каталаза является довольно устойчивым к различным факторам внешней среды. Каталаза устойчива в широком диапазоне температур с оптимумом активности 40оС [Error: Reference source not found, Error: Reference source not found], однако при повышении температуры фермент теряет свою активность. Каталаза довольно устойчива к воздействию ультрафиолетовых лучей. Даже относительно большая доза их (80 биодоз) в условиях in vitro снижает активность каталазы в среднем только на 13,6 %.

Сведения о воздействии на фермент ультразвука противоречивы. Из одних источников известно, что каталаза крови является довольно устойчивой к воздействию ультразвука ферментом, но все же, как и для большинства других ферментов, происходит ее инактивация; величины констант инактивации возрастают с увеличением мощности ультразвука и сильно зависят от рН среды и начальной концентрации каталазы в растворе, снижаясь с ее увеличением [Error: Reference source not found, Error: Reference source not found].

Методы определения активности каталазы основаны на регистрации образующегося в процессе реакции О2 (манометрическим или полярографическим методами) или на измерении текущей (спектрофотометрическим) или остаточной (пермангана-тометрическим, йодометрическим и другими титриметрическими методами) концентрации перекиси водорода [Error: Reference source not found, Error: Reference source not found].

Из всех методов, спектроскопия, калориметрия и титрование перманганатом наиболее достоверны для каталазы с умеренной или высокой степенью чистоты. В случае неочищенных ферментных препаратов, иодометрическое исследование и манометрический метод являются достаточно достоверными. Однако в йодометрическом титровании затруднено определение конечной точки, а манометрический метод более громоздкий, чем титрометрическое или фотометрическое исследование.