Влияние температуры на ферментативную активность Na-, к-атф-азы.

Принцип метода. При работе Na-, К-АТФ-аза от молекулы АТФ отщепляется одна молекула неорганического фосфора и остается одна молекула АДФ. По нарастанию неорганического фосфора в инкубационной среде судят об активности АТФ-азы:

АТФ → АДФ + Р_н.

Цель работы: установить зависимость скорости образования неорганического фосфора от температуры. Рассчитать коэффициент Вант-Гоффа и энергию активации.

Приборы:

Фотоэлектроколориметр (ФЭК), ультратермостат, аналитические весы, разновесы.

Посуда:

Чашки Петри, стеклянные пробирки объемом 10 мл, пипетки на 1 и 2 мл, фарфоровая чашка с пестиком.

Реактивы и материалы:

Фильтровальная бумага (синяя лента), 18 мМ раствор АТФ, 6,6% раствор молибденовокислого аммония, 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота), 2,5% раствор FeSO₄, 7,5 Н раствор H₂SO₄, 0,05 М трис-HCl с рН 7,5, 18 мМ раствор MgCl₂, 5,4 мМ NaCl, 18 мМ раствор KCl, ножницы.

Ход работы:

Перед началом опыта необходимо включить термостат (положение HI), предварительно поставив регулятор контактного термометра на 30⁰С. Работу нужно начинать только при достижении в термостате заданной температуры. Опыты состоят из 2 серий:

1) контроль и опыт при температуре инкубации 20⁰С (комнатная температура);

2) контроль и опыт при температуре инкубации гомогената при 30⁰С.

Для определения активности фермента берут 50 мг живой ткани (сердце, почка, нерв, мозг), растирают его в фарфоровой ступке с 3 мл трис-HCl буфера (рН 7,5). Полученный гомогенат доводят трис-HCl до конечного объема – 10 мл. После этого отбирают пипеткой 1 мл полученного гомогената и переносят его в пробирку, добавляют 4 мл инкубационной смеси. Инкубационная смесь состоит из 1 мл 0,05 М трис-HCl, 1 мл 18 мМ раствора MgCl₂, 1 мл 18 мМ раствора KCl, 1 мл 5,4 мМ NaCl, рН полученного раствора – 7,5. Затем пробирки первой серии выдерживают при 20⁰С 1 мин. После этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл 18 мМ раствора АТФ, в контрольную пробу до добавления АТФ вносят 1 мл 20% раствора ТХУ для инактивации фермента. После 5-минутной инкубации при 20⁰С реакцию прекращают добавлением 1 мл 20% раствора ТХУ (в контрольную пробу ТХУ второй раз не добавляют). Для дальнейшего анализа берут в пробирки по 1 мл исследуемого раствора (контрольный и опытный) и добавляют туда же 2 мл 7,5 н H₂SO₄, 2 мл 6,6% молибденовокислого аммония и 2 мл 2,5% раствора FeSO₄ (свежеприготовленного). Аналогичный опыт проводят при температуре 30⁰С.

Активность фермента определяют по калибровочной кривой в зависимости от величины оптической плотности КН₂РО₄ и концентрации раствора. Оптическую плотность определяют при длине волны 670 нм (красный светофильтр). Зная оптическую плотность исследуемого раствора, по калибровочной кривой нужно найти концентрацию неорганического фосфора в исследуемых растворах, определить температурный коэффициент Вант-Гоффа и рассчитать энергию активации.

Пример. В ходе опыта установлено, что количество неорганического фосфора, образовавшегося в ходе гидролиза АТФ, при 20⁰ С (Т₁ = 273 + 20 = 293) составило 0,9 мкг, при 30 ⁰ С - 1,53 мкг (Т₂ = 273 + 30 = 303).

На основании полученных данных вычисляем температурный коэффициент:

Q₁₀ = = 1,7.

Подставив в формулу (1.1) значение десятичного логарифма величины Q₁₀, равное 0,23045, и выразив показания температуры в градусах абсолютной шкалы, получим численную величину энергии активации:

Е = 0,46• (273 + 20) • (273 + 30) •0,23045 = 9,41 кДж/моль.