Задание 27. Определение количества хлорофилла в листьях колориметрическим методом

Количество хлорофилла в листьях растений подвергается значительным колебаниям, которые определяются внутренними особенностями (видом растения, возрастом органа) и условиями внешней среды (интенсивностью света, температурой, минеральным питанием и др.). Содержание зеленых пигментов и его динамика в растениях существенно влияют на интенсивность фотосинтеза и продуктивность организма. Поэтому в эксперименте часто ставят задачу учета количества хлорофилла, для чего применяют колориметры и спектрофотометры различных систем.

Целью настоящей работы является знакомство с колориметрическим методом определения содержания суммы хлорофиллов в листьях различных видов растений, подтверждение визуальных наблюдений за окраской растений количественными данными.

Ход работы. Работа состоит из двух этапов: 1 - получение спиртового экстракта пигментов и 2 - определение его концентрации. Для приготовления раствора хлорофилла используют свежие листья растений. Величина навески зависит от количества хлорофилла в листе. При работе с интенсивно зелеными листьями достаточно 0,25–0,50 г, слабоокрашенных тканей брать в пробу 1 г и более. Навеску поместить в фарфоровую ступку и растереть пестиком до однородной массы. Для лучшего измельчения тканей необходимо к навеске перед растиранием добавить немного кварцевого песка или битого стекла. Чтобы не произошло феофитинизации хлорофилла за счет эндогенных кислот, для нейтрализации последних добавить щепотку мела.

К растертой массе прилить небольшое количество этанола, снова тщательно растереть. Содержимое ступки количественно перенести на воронку с фильтром. Использовать фильтр с белой лентой. Его размер подбирать так, чтобы края фильтра не были выше краев воронки. Особое внимание обратить на аккуратное перенесение зеленой массы на фильтр. Эту операцию надо осуществлять без потерь, соблюдая следующие правила:

-носик ступки с внешней стороны смазать тонким слоем вазелина;

-переносить жидкость по стеклянной палочке;

-ступку при сливании жидкости наклонять резко, а значит, порция спирта не должна приливаться больше той, что вместится в воронку за один прием.

Ступку и пестик ополаскивать небольшими порциями спирта и переносить его на фильтр до тех пор, пока не останется следов зеленых пигментов на ступке, пестике и фильтре. Фильтрат собрать в мерную колбу на 25-50 мл, после полного извлечения пигментов довести этанолом до метки, тщательно перемешать и использовать для количественного определения хлорофилла с помощью колориметра Дюбоска или на фотоэлектроколориметре (ФЭКе).

Определение содержания хлорофилла на ФЭКе.

Бывают различные конструкции фотоэлектроколориметров. В любом случае, прежде чем определять оптическую плотность исследуемого раствора, измеряют плотность серии стандартных растворов со стандартной концентрацией. По результатам этих определений строится калибровочная кривая. При работе с хлорофиллом используют раствор Гетри в качестве стандартного раствора.

Раствор зеленых пигментов следует колориметрировать с красным светофильтром. Описание устройства прибора и работы на нем дано в дополнительной инструкции, прилагаемой к ФЭКу.

Таблица 20.

Схема записи опыта

Объект	Навеска, г	Объем вытяжки, мл	Оптичес-кая плотность раствора (D)	Концентра- ция хлорофил- ла (мг) в 1мл раствора, определенная по калибровочному графику	Содержание хлорофилла в вытяжке, мг	Содержание хлорофилла, к сырому ве ществу, %

По шкале прибора определите оптическую плотность раствора; по плотности на калибровочном графике найдите количество хлорофилла (мг) в 1 мл вытяжки. Зная навеску листьев и количество в ней хлорофилла, рассчитайте процентное содержание пигментов в свежих листьях.