Решение типовых задач

Задача 1. У бактерий Escherichia coli было получено 5 мутантов, затрагивающих разные этапы одного и того же биосинтетического пути (схема пути приведена на рис. 4), и изучена их способность к росту на среде, содержащей соединения (I–V), являющиеся предшественниками конечного продукта VI (табл. 3). Вам необходимо определить правильную очередность синтеза соединений I-VI в рассматриваемом биосинтетическом пути, а также идентифицировать мутанты, т.е. определить этап, где произошла мутация у каждого из них.

Таблица 3

Характеристика мутантов Escherichia coli

Мутанты	Соединения
	I	II	III	IV	V	VI
1	-	-	-	+	-	+
2	-	+	-	+	-	+
3	-	-	-	-	-	+
4	-	+	+	+	-	+
5	+	+	+	+	-	+

«+» – есть рост, «-» – нет роста.

Решение:

При решении задач подобного типа следует помнить, что если исследуемый ауксотрофный мутант растет на среде только в случае добавки необходимого метаболита, то у него блокирован какой-то этап биосинтетического пути на этапе, предшествующем этому метаболиту, то есть метаболит занимает в цепи место после мутационного блока. Другие более ранние предшественники, находящиеся в биосинтетическом пути перед блоком, не могут обеспечить рост мутанта. С другой стороны, если мутант накапливает определенный метаболит, то у него блокирован этап пути биосинтеза сразу же после накапливаемого метаболита. Например, в случае соединения V мы видим, что оно не обеспечивает рост ни одного из мутантов. Следовательно, в рассматриваемом биосинтетическом пути соединение V является самым первым предшественником. Затем следует соединение I, которое обеспечивает рост только одного мутанта (а именно, мутанта № 5), значит, в биосинтетическом пути оно располагается следующим. Затем следует соединение III и т.д. Следовательно, очередность синтеза соединений I-VI должна быть следующей: VIIIIIIIVVI.

Подобным образом рассуждаем и в случае идентификации мутантов. Поскольку мутант 5 не растет на соединении V, значит, мутация у него произошла на участке VI. Мутант 4 не растет уже на двух соединениях – V и I, следовательно, мутация у него произошла на следующем участке между IIII. Мутант 2 не может расти на соединениях V, I и III, следовательно, мутация у него произошла на участке IIIII. Рассуждая подобным образом и далее, определяем местоположение всех остальных мутаций.

Ответ.

Мутанты: 5 4 2 1 3

Путь: V I III II IV VI.

Такой принцип идентификации мутантов применим для любого биосинтетического пути, и является универсальным как для прокариотических, так и эукариотических организмов.

Задача 2. Три независимых триптофан-зависимых мутанта дрожжей, обозначенных trp B, trp D и trp E, соответственно, были ресуспендированы в физиологическом растворе и нанесены на агаризованную среду без триптофана в виде полосок, таким образом, что отдельные штрихи не соприкасались между собой, но могли использовать для своего роста метаболиты других мутантов (рис. 5). После выращивания мутантов в течение 2-3 суток был зарегистрирован рост дрожжевых клеток, как указано на рисунке. Проанализируйте результаты эксперимента и определите, какова очередность действия генов триптофанового пути у дрожжей?

Рис. 3. Характер роста мутантных дрожжей (trp B, trp D и trp E) на среде без триптофана.

Решение:

Учитывая, что наличие роста на конкретном соединении говорит о том, что блок биосинтетического пути находится на более раннем его этапе, производим ана-

лиз картины роста мутантов дрожжей. Мы видим, что мутант trp E растет хорошо, и, следовательно, способен использовать для роста метаболиты мутантов trp D и trp B.

Значит в пути синтеза триптофана, фермент, кодируемый геном trp E, действует первым. Рост мутанта trp D слабый и неравномерный, этот говорит о том, что только один из двух мутантов обеспечивает его необходимым фактором роста. Поскольку мутант trp E имеет самый «ранний» блок триптофанового пути и не способен синтезировать метаболиты для «подпитки» других мутантов, следовательно, только клетки мутанта trp B синтезируют нужное для его роста соединение. Действительно, pост клеток мутантa trp D является более обильным в участке, приближенном к месту посева мутанта trp B. Значить фермент, кодируемый геном trp D, работает следующим.

Ответ. Последовательность генов в биосинтетическом пути:

trp E→ trp D → trp B.

Задача 3. В таблице приведены результаты теста на комплементарность для десяти точковых мутаций. «+» – комплементация мутации; «-» – отсутствие комплементации. По результатам, приведенным в таблице, определите группы комплементации.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	-	+	+	+	+	-	-	+	+	+
2		-	+	+	+	+	+	+	+	-
3			-	-	-	+	+	-	-	+
4				-	-	+	+	-	-	+
5					-	+	+	-	-	+
6						-	-	+	+	+
7							-	+	+	+
8								-	-	+
9									-	+
10										-

Решение:

1). Анализируем первую горизонтальную строку. Мы видим, что при скрещивании первого мутанта с шестым и седьмым мутантом не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, эти мутации затрагивают одну область гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к одной группе комплементации. При скрещивании первого мутанта со вторым, третьим, четвертым, пятым, восьмым, девятым и десятым мутантом происходит комплементации мутации (знак «+»), следовательно, эти мутации затрагивают разные области гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к другой группе комплементации.

2). Анализируем вторую горизонтальную строку. Мы видим, что при скрещивании второго мутанта с мутантом десять не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, эти мутации затрагивают одну область гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к одной группе комплементации.

3). Анализируем третью горизонтальную строку. Мы видим, что при скрещивании третьего мутанта с мутантами четыре, пять, восемь и девять не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, эти мутации затрагивают одну область гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к одной группе комплементации.

Ответ: Группа 1: мутанты 1, 6, 7.

Группа 2: мутанты 2, 10.

Группа 3: мутанты 3, 4, 5, 8, 9.

Задача 4. В результате эксперимента, получено пять делеционных варианта гена Х и пять точковых мутанта этого гена. Карта делеций представлена на рис.6. Пять точковых мутанта скрестили с делеционными вариантами. Результаты скрещивания представлены в таблице.

1
	2
		3
			4
				5

Рис.6. Делеционные варианты гена Х

Делеция	Точковый мутант
	а	b	c	d	e
1	-	-	-	-	-
2	-	-	+	-	-
3	-	-	+	+	-
4	+	-	+	+	-
5	+	-	+	+	+

Решение:

Как указывалось выше, при скрещивании точкового и делеционного мутанта рекомбинанты появляются только тогда, когда делеция не затрагивает участок, в котором локализована точковая мутация. Делеции разделяют карту гена Х на пять областей (рис.6). Если при скрещивании точкового мутанта происходит рекомбинация только с некоторыми делециями, то эта точковая мутация локализована слева от самой протяженной делеции с которой произошла рекомбинация.

1. Анализируем результаты скрещивания мутанта а. Как видно из первого столбца таблицы при скрещивании точкового мутанта а с делеционными мутантами 4 и 5 происходит рекомбинация (знак «+»), а при скрещивании с делециями 1, 2 и 3.рекомбинация не происходит (знак «-»). Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 3.

2. Анализируем результаты скрещивания мутанта b. Как видно из второго столбца таблицы при скрещивании точкового мутанта b с делеционными мутантами не происходит рекомбинация не с одной делецией (знак «-»). Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 5.

3. Анализируем результаты скрещивания мутанта с. Как видно из третьего столбца таблицы при скрещивании точкового мутанта с с делеционными мутантами 2, 3, 4 и 5 происходит рекомбинация (знак «+»), а при скрещивании с делецией 1 рекомбинация не происходит (знак «-»).Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 1.

4. Анализируем результаты скрещивания мутанта d. Как видно из таблицы при скрещивании точкового мутанта d с делеционными мутантами происходит рекомбинация мутации с делециями 3, 4 и 5 (знак «+»), но не рекомбинирует с делециями 1 и 2 (знак «-»). Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 2.

5. Анализируем результаты скрещивания мутанта е. Как видно из таблицы мутант е рекомбинирует с делецией 5, но не рекомбинирует с делециями 1, 2, 3 и 4. Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 4.

Ответ:

1	2	3	4	5
c	d	а	e	b

Задача 5. В таблице представлены результаты попарных скрещиваний между пятью rII-делециями. «+» – комплементация мутации; «-» – отсутст-вие комплементации. Постройте карту делеций с указанием относительной длинны каждой из них. Какие из этих мутаций могли бы быть точковыми?

	1	2	3	4	5
1	-	-	-	-	+
2		-	-	+	+
3			-	+	+
4				-	-
5					-

Решение:

1). Анализируем графы таблицы для определения самой протяженной делеции. Как видно из таблицы при скрещивании первого делеционного варианта с другими делециями комплементация происходит только при скрещивании с делецией 5 (знак «+»), следовательно, делеция 1 является самой протяженной.

2). Наносим на карту делецию которая комплементирует мутацию при скрещивании с самой протяженной. Это делеция 5. Отмечаем делецию 5 справа или слева от делеции 1.

3). При скрещивании делеции 2 с делецией 1 не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, она затрагивает делецию 1, но при скрещивании делеции 2 с делецией 5 происходит комплементация мутации (знак «+»), следовательно, она не затрагивает делецию делецию 5.

4). При скрещивании делеции 3 с делециями 1 и 2 не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, она затрагивает делецию 1 и 2, но при скрещивании делеции 3 с делецией 5 происходит комплементация мутации (знак «+»), следовательно, она не затрагивает делецию делецию 5.

5). При скрещивании делеции 4 с делецией 1 и 5 не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, она затрагивает эти делеции, но при скрещивании делеции 4 с делециями 2 и 3 происходит комплементация мутации (знак «+»), следовательно, она не затрагивает делеции 2 и 3.

Ответ. Карта rII-делециями делеций:

1

2

3 5

4

Точковыми могли бы быть мутации 5, 3, 2.

Задача 6. У Pseudomonas putida получены ауксотрофные мутанты дефектные по различным этапам синтеза триптофана. Используя характеристику мутантов, приведенную в таблице, определите последовательность стадий биосинтеза триптофана у этих бактерий.

	Рост на средах с предшественником
	хоризмат	антранилат	КДРФ	индол	триптофан
trpB	-	-	-	-	+
trpE	-	+	+	+	+
trpC	-	-	-	+	+
trpA	-	-	-	+	+
trpD	-	-	+	+	+

Решение:

Если мутант не растет на минимальной среде, а способен к росту только при внесении в среду определенного предшественника синтеза триптофана, то у него блокирован этап метаболической цепи перед биосинтезом этого метаболита.

1. Мутант trpE растет при добавлении в среду любого предшественника, кроме хоризмата, следовательно, у него блокирован самый ранний этап синтеза триптофана сразу после синтеза хоризмата.

2. Мутант trpD способен расти на средах со всеми промежуточными продуктами синтеза триптофана, кроме антранилата и КДРФ. Это означает, что мутационный блок располагается сразу после синтеза антранилата, который в цепи биосинтеза находится сразу после хоризмата.

3. Мутант trpC способен использовать для своего роста триптофан, и индол, но не антраниловую кислоту и КДРФ. Следовательно, мутация trpC прерывает цепь биосинтеза сразу после КДРФ, который располагается в цепи синтеза после антраниловой кислоты, но перед индолом и триптофаном.

4. Мутант trpA растет только на среде с триптофаном и индолом. Можно заключить, что цепь биосинтеза у него блокирована на этапе между индол-3-глицерофосфатом и индолом.

5. Мутант trpВ растет только на среде с триптофаном. Можно заключить, что цепь биосинтеза у него блокирована на этапе между индолом и триптофаном.

Таким образом, последовательность метаболитов в цепи био­синтеза триптофана следующая: хоризмовая кислота → антраниловая кислота → КДРФ →индол → индол-3-глицерофосфат → триптофан.