Часть2.

6 Семестр.

19 Занятий по 3 академических часа. Заключительные практические занятия: 13, 17 занятие № 1 (лабораторная работа)

ТЕМА: Определение молекулярного веса белков методом гель-фильтрации

Цель: Изучить методы определения молекулярной массы. Приобрести навыки определения молекулярной массы биомакромолекул методом гель-фильтрации

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Основные методы определения молекулярной массы макромолекул.

2. Теоретические основы гель-хроматографии.

3. Выполнение практической работы по определению молекулярной массы белков с помощью гель-хроматографии.

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: растворы голубого декстрана и белковые растворы 10 мг/мл по 2 мл каждого (фибриноген, лактатдегидрогеназа, гемоглобин, альбумин бычий, трипсин, ингибитор трипсина соевый).

1. Ознакомление с элементами управления хроматографа (с помощью преподавателя).

2. Включить насосы, блок управления и детектор хроматографа.

3. Открыть кран выхода элюата с детектора.

4. При возникновении сбоя в управлении проверить состояние насосов (обнулить детектор превышения давления SET LIMIT на насосах) и восстановить систему (alarm reset на блоке управления, см. рис.).

5. Включить ручное управление (manual на блоке управления, см. рис.).

6. С помощью клавиш step forward и step backward перейти в режим VALVE и переключить поток на необходимую колонку (№Х) (путем ввода 2.Х DO/STORE., 3.Х DO/STORE).

7. Установить скорость потока 1 мл/мин.

Калибровка

8. Ввести раствор первого белка в инжектор (до появления на выходе трубки 4).

9. Переключить инжектор на ввод в колонку (VALVE 1.2 DO/STORE).

10. Включить протяжку бумаги на самописце 2 мм/мин (= ___ мл/мм).

11. Через 1 мин перевести инжектор в исходное состояние (VALVE 1.1 DO/STORE)

12. Вести регистрацию 20-30 мин. до возврата пера до нулевой линии.

13. Повторить пункты 8-12 для второго белка и для исследуемой пробы.

14. Определить свободный объем колонки, используя раствор декстрана.

15. Построить калибровку (зависимость К от logМ), используя полученное значение свободного объема.

Задание по группам

Группа.	Калибровочный белок №1	Калибровочный белок №2	Определяемый белок
	1	2	3
1	Фибриноген, .....кД	Гемоглобин, .....кД	ЛДГ, .....кД
2	Фибриноген, .....кД	Гемоглобин, .....кД	Альбумин бычий, .....кД
3	Фибриноген, .....кД	Трипсин, .....кД	Гемоглобин, .....кД
4	Гемоглобин, .....кД	Трипсин, .....кД	Альбумин бычий, .....кД
5	ЛДГ, .....кД	Гемоглобин, .....кД	Альбумин бычий, .....кД

K=(V_e-V₀)/V_s, где

V_t - общий объем колонки =

V₀ – холостой объем, по выходу декстрана =

V_s – объем геля = V_t-V₀ =

V_e – объем выхода белка, =

K₁ =

K₂ =

K₃ =

Самостоятельная работа

1. Принципы методов определения молекулярной массы.

2. Понятие о других физических методах, которые используются для определения размера и формы частиц.

3. Какие факторы определяют скорость движения молекулы при ультрацентрифугировании. Характер зависимости.

4. Какие факторы определяют скорость движения молекулы при электрофорезе. Характер зависимости.

5. Теоретические основы гель-хроматографии. Выбор адекватного носителя для определения молекулярной массы.

6. Методика определения молекулярной массы с помощью гель-хроматографии.

7. Основные элементы жидкостного хроматографа.

8. Что такое холостой объем колонки и как его определить?

9. Как рассчитать общий объем колонки?

10. Что такое элюент, элюат?