Алгоритм лабораторної роботи.

1. Вивчення термолабільності ферментів.

Слину розвести у 5 разів (1 мл слини + 4 мл води). 2 мл розведеної слини кип’ятити 5 хвилин. У 3 пробірки налити по 10 крап. 1% розчину крохмалю. У першу пробірку додати 10 крап. води (контроль), у другу – 10 крап. охолодженої прокип’яченої слини, у третю – 10 крап. розведеної слини.

Усі пробірки помістити у водяну баню або термостат при температурі 38 ⁰С на 10 хвилин. Після цього виконати якісні реакції на крохмаль і продукти його гідролізу (глюкозу та мальтозу).

Реакція на крохмаль: до 5 крап. досліджуваного розчину додати 1 крап. розчину Люголю (КІ₃). В присутності крохмалю з’являється синє забарвлення.

Реакція Фелінга: до 5 крап. досліджуваного розчину додати 3 крап. розчину Фелінга (CuSO₄ + NaOH), підігріти. В присутності глюкози чи мальтози випадає жовтий осад гідрату закису міді або червоний осад закису міді.

2. Вивчення залежності активності ферментів від рН середовища.

Слину розвести у 10 разів (1 мл слини + 9 мл води). В 3 пробірки налити по 1 мл буферних розчинів з рН 3; 7,4; 14. В кожну пробірку відміряти по 1 мл розведеної слини, по 1 мл 1% розчину крохмалю, перемішати та інкубувати 10 хв. при температурі 38 ⁰ С. Після цього під контролем індикаторного паперу нейтралізувати вміст пробірки з рН 3 - розчином лугу, а вміст пробірки з рН 14 – розчином 0,1н HCl.

Результат досліду виявити за допомогою розчину Люголя, додаючи його по 1-2 крап. в кожну пробірку, розмішати, відмітити забарвлення і зробити висновки.

Тема 2. Визначення активності ферментів. Дослідження ферментних процесів за типом реакцій основних класів ферментів. Дослідження механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу.

Актуальність теми.

Кількісне визначення активності ферментів у біологічному матеріалі використовується для діагностики різних хвороб. Так при гострому панкреатиті підвищується активність амілази в крові та сечі. Складна будова та функціональна організація ферментів частково є ключем до розуміння характерних властивостей ферментів – високої специфічності та швидкості каталізу. Велику роль у розвитку уявлень про механізм дії ферментів відіграли класичні роботи Міхаеліса і Ментен, які розробили положення про фермент-субстратні комплекси.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Аналізувати зміну активності ферменту амілази в біологічних рідинах. Вивчення міжнародної класифікації ферментів за типом реакцій.

Вивчення механізмів дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу. Знати методи визначення активності ферментів, а також вміти інтерпретувати ці методи.

Конкретні цілі:

1. Кількісно визначати активність амілази в сечі за Вольгемутом, трактувати отримані результати.

2. Трактувати міжнародну класифікацію та номенклатуру ферментів за типом реакцій.

3. Аналізувати механізми дії ферментів.

4. Пояснити методи визначення активності ферментів

5. Пояснити кінетику ферментативного каталізу.

Вихідний рівень знань-вмінь: знати поступовий гідроліз молекули крохмалю до мальтози через стадію декстринів. Знати типи хімічних реакцій. Знати біологічну роль та структуру ферментів, фізико-хімічні властивості білків.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

Зміст і послідовність дій	Вказівки до навчальних дій
1. Практичне вивчення визначення амілази слини.	1.1. Визначення активності амілази слини.
2. Методи визначення активності ферментів.	2.1. На конкретних прикладах поясніть принципи методів визначення активності ферментів: а) за кількістю продукту, який утворюється під дією ферменту за одиницю часу; б) за кількістю витраченого субстрату за одиницю часу; в) спектрофотометричні методи визначення активності ферментів та візуалізація результатів ферментативної реакції. 2.2. Одиниці виміру активності та кількості ферментів: а) міжнародні одиниці; б) катал; в) питома активність ферменту.
3. Міжнародна класифікація та номенклатура ферментів за типом реакцій.	3.1. Пояснити принцип міжнародної класифікації і номенклатури ферментів. 3.2. Назвати шість класів ферментів та пояснити типи каталізованих ними реакцій.
4. Механізми дії ферментів.	4.1. Термодинамічні закономірності ферментативного каталізу. 4.2. Активні центри ферментів. Відмінності будови активних центрів у простих та складних ферментів. 4.3. Ферментативне перетворення субстратів за каталітичної дії ферменту на прикладі дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази. Послідовність етапів каталітичного процесу.
5. Кінетика ферментативних реакцій.	5.1. Залежність швидкості реакцій від концентрації ферменту, субстрату, рН та температури. 5.2. Константа Міхаеліса-Ментен, її смислове значення.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

Зробити реферативні доповіді за темами : ”Роль підшлункової залози в виникненні гіперамілаземії і гіперамілазурії”; “Механізм дії ферментів”