Подготовка стекол

Подготовка стекол. Стекла (бывшие в употреблении и новые) замачивают в 2% растворе хозяйственного мыла или стирального порошка (20,0 г порошка растворяют в 975 мл воды и добавляют 20 мл пергидроля) в эмалированной посуде на 8—10 ч. Старый мазок удаляют ватным тампоном и кипятят стекла в этом же растворе 5—10 мин. Кипячение более 10 мин и использование алюминиевой посуды приводят к помутнению стекол. Затем стекла промывают в проточной воде, насухо вытирают и выбо­рочно проверяют полноту отмывки от щелочных добавок мою­щих средств с помощью спиртового раствора фенолфталеина (1 г/л) путем нанесения 2—3 капель на стекло (розовое окрашивание не должно появляться). Отмытые стекла помещают на 30—60 мин в смесь Никифорова (этиловый спирт 96° и диэтиловый эфир в соотношении 1:1), после чего их хранят в закрытой чистой посуде.

Техника приготовления мазков. Мазок крови готовится шли­фованным стеклом с идеально ровным краем, ширина которого должна быть приблизительно на 2—3 мм уже предметного стек­ла. К куполу свежевыпущенной из прокола капли крови прика­саются предметным стеклом на расстоянии 1,5—2 см От его края, не касаясь кожи в месте укола. Капля крови на предметном стекле должна иметь диаметр 2—3 мм (рис. 16).

Шлифованное стекло ставят на предметное под углом 45° на 1—2 мм перед каплей, затем сдвигают назад так, чтобы оно кос­нулось крови и капля растеклась по краю шлифованного стекла. Затем быстрым легким движением справа налево делают мазок. Вся капля на предметном стекле должна быть исчерпана. При этом условии мазок заканчивается неровно — «метелочкой».

Правильно сделанный мазок должен занимать примерно 3/4 предметного стекла, иметь начало, хорошо выраженные края, быть тонким и равномерным. Тонкий мазок желтоватого цвета, полупро­зрачен, форменные элементы в нем располагаются в один слой. Толстый мазок не пригоден для исследования, так как клетки в нем располагаются в несколько слоев и деформируются.

Высохший на воздухе мазок подписывают простым (не хими­ческом) карандашом или углом предметного стекла ближе к началу мазка (более толстая, не исполь­зуемая для исследованиячасть), указывая фамилию и инициалы пациента или его регистраци­онный номер, дату. Для анализа делают не менее двух мазков.

Сухие мазки опускают в широкогорлую банку с фиксатором на необходимое для фиксации время. Затем извлекают пинцетом и высушивают на воздухе. При этом необходимо следить, чтобы поверхности стекол с мазками не соприкасались друг с другом. Фиксацию мазков можно проводить и в специальных контейне­рах, опуская их в кювету с фиксатором.

Окраска мазков. Для окраски используется смесь двух краси­телей — Кислого (эозин калия) и основного (метиленовый синий и его производные — азурI и азурИ).

Основу методов окраски клеток крови заложил петербург­ский врач Д. Л. Романовский в 1891 г., предложив окрашивать препараты одновременно двумя красителями, один из которых имеет щелочную реакцию (метиленовый синий), другой — кис­лую (эозин). В дальнейшем появились и применяются по на­стоящее время различные модификации окрашивания клеток (методы Романовского — Гимза, Нохта, Папенгейма, Райта).

Окраска по Романовскому — Гимзе

В состав краски входят: азурИ (смесь равных количеств азура1 и метиленового синего) и эозин. Краску выпускают готовую во флаконах из темного стекла с указанием на этикетке даты выпуска и серии, а также в порошке. Для приготовления основ­ного раствора навеску сухой краски 3,8 г растворяют в 250 мл метилового (лучше) или этилового 96° спирта. Раствор оставляют на 3—5 сут, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем приливают 250 мл химически чистого глицерина и вновь оставляют на 3—5 дней, часто помешивая. Приготовленный та­ким образом основной раствор краски хорошо сохраняется дли­тельное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей. Основной раствор краски Романовского — Гимзы концентрирован, нуждается в разведении перед использованием. Перед употреблением готовый или приготовленный основной раствор красителя проверяют на активность. В трех цилиндрах готовят различные разведения краски из расчета 1 капля концен­трированного красителя на 1 мл нейтральной дистиллированной воды, 2 капли на 1 мл, 3 капли на I мл. Каждым из растворов окрашивают 5—6 зафиксированных мазков крови в течение раз­личного времени: 20, 25, 30, 35 и 40 мин. На каждом мазке от­мечают время, в течение которого он будет окрашен. Затем краску с мазков смывают нейтральной дистиллированной водой. Мазки высушивают, микроскопируют и определяют разведение краски и время, при которых получена наилучшая окраска. Раз­ведение принимается за титр данной серии краски, а время окраски — за постоянную экспозицию. Эти данные указывают на этикетке бутыли. Например, 3 капли красителя на 1 мл дис­тиллированной воды, экспозиция — 25 мин. Для окраски мазков крови всегда используют свежеприготовленный рабочий раствор краски. Для разведения краски лучше всего пользоваться фос­фатным буфером.

Техника приготовления мазков. Мазок крови готовится шли­фованным стеклом с идеально ровным краем, ширина которого должна быть приблизительно на 2—3 мм уже предметного стек­ла. К куполу свежевыпущенной из прокола капли крови прика­саются предметным стеклом на расстоянии 1,5—2 см От его края, не касаясь кожи в месте укола. Капля крови на предметном стекле должна иметь диаметр 2—3 мм (рис. 16).

Шлифованное стекло ставят на предметное под углом 45° на 1—2 мм перед каплей, затем сдвигают назад так, чтобы оно кос­нулось крови и капля растеклась по краю шлифованного стекла. Затем быстрым легким движением справа налево делают мазок. Вся капля на предметном стекле должна быть исчерпана. При этом условии мазок заканчивается неровно — «метелочкой».

Правильно сделанный мазок должен занимать примерно 3/4 предметного стекла, иметь начало, хорошо выраженные края, быть тонким и равномерным. Тонкий мазок желтоватого цвета, полупро­зрачен, форменные элементы в нем располагаются в один слой. Толстый мазок не пригоден для исследования, так как клетки в нем располагаются в несколько слоев и деформируются.

Высохший на воздухе мазок подписывают простым (не хими­ческом) карандашом или углом предметного стекла ближе к началу мазка (более толстая, не исполь­зуемая для исследованиячасть), указывая фамилию и инициалы пациента или его регистраци­онный номер, дату. Для анализа делают не менее двух мазков.

Фиксация мазков предохраня­ет форменные элементы крови от воздействия содержащейся а красках воды, под влиянием ко­торой в нефиксированных препа­ратах происходит гемолиз эрит­роцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксатор также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле. Наилучшими фиксаторами являются метиловый спирт (химически чистый, время фиксации 3—5 мин) или раствор эозинметиленового синего по Май — Грюнвалвду. При отсутствии указанны* фиксаторов используют этиловый спирт 96° (время фик­сации 30 мин), денатурированный спирт (30 мин), хлороформ (несколько секунд), формалин (1 мин), ацетон (5 мин), смесь Ни­кифорова (20 мин).

Окраска по Нохту

Реактивы.

1. I г азураII в I л дистиллированной воды.

2. 1 г водорастворимого желтого эозина в 1 л дистиллирован­ной воды. Каждый из этих растворов хорошо перемешивают и оставляют созревать при ежедневном встряхивании на 10—14 сут.

Рабочий раствор краски готовят перед употреблением путем смешивания 26 мл основного раствора азураП, 20 мл основного раствора эозина К и 55 мл буферного раствора.

Пропорции красителей могут несколько варьировать и долж­ны быть установлены опытным путем при приготовлении свежей партии основных растворов красителей. Окраску производят в кюветах или на «рельсах» так же, как методом Романовского — Гимзы.

Окраска по Паппенгейму

Реактивы.

1. Готовый фиксаторкраситель Май — Грюнвальда. При отсут­ствии готового раствора раствор Май — Грюнвальда готовят рас­творением 5 г сухого эозинметиленового синего в I л химиче­ски чистого метилового спирта. Раствор готов к употреблению через 4 дня.

2. Свежеприготовленный раствор краски Романовского — Гимзы или рабочий раствор азурэозина по Нохту.

Ход исследования. Мазки не нуждаются в предварительной фиксации, так как краска Май — Грюнвальда, приготовленная на метиловом спирте, одновременно фиксирует и красит мазок. На нефиксированный мазок наносят 2 мл краски Май — Грюнвальда на 3 мин. Затем доливают столько же дистиллиро­ванной воды и оставляют еше на I мин. Краску сливают, смы­вают ее водой и на 15—20 мин заливают мазки краской Рома­новского — Гимзы или раствором азурэозина по Нохту. Мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.

Аналогичным методом можно окрашивать мазки в кюветах. Контейнер с мазками помешают в кювету с раствором Май — Грюнвальда на 3—5 мин, ополаскивают в кювете с дистиллиро­ванной водой и докрашивают в растворе красителя Романов­ского — Гимзы или Нохта 15—20 мин. Время окраски устанав­ливают опытным путем для каждой новой партии красителя.