3. Оптические измерительные приборы

К оптическим измерительным приборам, используемым в клинической лабораторной диагностике, относятся

— фотометры и спектрофотометры;

— денситометры, предназначающиеся для сканирования, т. е. количественного определения содержания разделенных на носителях (хроматографической бумаге, пленках ацетатцеллюлозы, геле, пластинах с тонким слоем силикагеля) веществ;

— нефелометры и турбидиметры, позволяющие судить о содержании взвешенных частиц в объеме жидкости по интенсивности светорассеяния (используются, в частности, для оценки выраженности коллоидно-осадочных реакций);

— флюориметры, применяемые для определения концентрации сложных органических веществ (витаминов, гормонов и др.) путем измерения интенсивности флюоресценции (в том числе поляризационные);

— люминометры, измеряющие количество излученного света (светосумму), зависящее от содержания в биологических жидкостях некоторых веществ (ацилгидро-перекиси и других), при разложении которых ионами металлов переменной валентности либо другими реактивами происходит кратковременное излучение света;

— пламенные фотометры, используемые для измерения интенсивности светоизлучения (эмиссии) внесенных в пламя ионов металла;

— атомные абсорбциометры, определяющие содержание ионов металлов (в том числе относящихся к микроэлементам) в разных биологических жидкостях; при измерениях, как и в методе фотометрии пламени, анализируемый раствор вводится в пламя в виде аэрозоля с помощью распылителя. Однако измеряется не излучение, а поглощение монохроматического светового потока атомами исследуемого элемента. Метод позволяет определить содержание элементов, находящихся в пламени в виде свободных атомов;

— атомно-эмиссионные многоканальные спектрометры. Методика исследования на приборах такого типа сводится к следующему. Подготовленная к анализу проба помещается в камеру, где под действием электрического разряда вещество испаряется, а его атомы возбуждаются. Излучаемый атомами световой поток специальной опти-

ческой системой направляется в полихроматор, где происходит его разложение по спектральным составляющим. Регистрация спектра осуществляется с помощью оптического многоканального анализатора, что позволяет по оценке интенсивности или площади спектральных линий установить содержание 10 и более химических элементов в одной пробе.

Фотометры. На измерительном барабане широко распространенных в прошлом фотометров (типа ФЭК М, ФЭК Н 57 и др.) шкала оптических плотностей обозначена красным цветом, а шкала пропускания — черным.

Если оптическая плотность раствора соответствует 1, то через его слой проходит 10% интенсивности падающего светового потока (остальные 90% поглощаются). Для большинства современных автоматизированных приборов это крайне большая величина, превышение которой не гарантирует получения надежных результатов измерения. Во всех выпускавшихся ранее фотометрах наибольшая точность измерения достигается при значениях абсорбции около 0,3 (в этом случае через раствор проходит половина падающего на него светового потока); по мере ее снижения точность измерения, а следовательно, и достоверность полученных результатов уменьшаются.

Полученное значение абсорбции (оптической плотности) есть произведение величины концентрации на толщину слоя раствора. Практически одинаковые показатели экстинкции получают при фотометрии исходного раствора в кювете с длиной оптического пути 1 см и того же раствора, предварительно разведенного в 2 раза, но в кювете с длиной оптического пути 2 см. К повышению чувствительности измерения приводит удлинение оптического пути за счет сокращения поперечного сечения кюветы (при этом объем раствора остается прежним). Однако возможности этого приема фотометрии ограничены: чем уже и длиннее кювета, тем более высокие требования предъявляются к фокусировке и юстировке луча света. Поэтому большинство клинико-биохимических исследований рассчитано на проведение измерений в кювете с длиной оптического пути 1 см; значительно реже используется кювета с длиной оптического пути 0,5 см, еще реже — кюветы с длиной оптического пути 2 см. Следует стремиться к тому, чтобы фотометрия осуществлялась в кюветах с толщиной слоя 1 см: доказано, что этот режим фотометрии самый выигрышный. Повышение чувствительности фотометрического исследования обычно достигается путем использования особых по конструкции (узких и длинных) кювет, позволяющих значительно уменьшить объем фотометрируемого раствора. Однако нужно иметь в виду, что при уменьшении объема раствора до величины меньше 0,5 мл точность фотометрического измерения снижается и возрастает вероятность появления ошибки. В большинстве современных биохимических анализаторах используются кюветы с длиной оптического пути 1 см при объеме внесенной в них жидкости 0,5—1,0 мл.

Благодаря использованию проточных кювет точность фотометрии значительно возрастает, поскольку отпадает необходимость каждый раз вынимать кювету для заполнения ее новой порцией исследуемого раствора, что сделало процедуру измерения также и более быстрой и удобной (спектрофотометр «СОЛАР» РУ 1251 С, «Кормей Плюс»),

Фотометрические приборы представлены обычными фильтровыми фотометрами и спектрофотометрами, в которых отдельные участки спектра выделяют при помощи призм или диффракционных решеток; это позволяет установить любую длину волны в весьма большом диапазоне (спектрофотометры типа СФ 4, СФ 26, СФ 46, РУ 1251 С «СОЛАР» и др.).

При выполнении клинико-биохимических исследований фотометрия чаще всего проводится в области длин волн 400—700 нм. Особенно широко распространена регистрация содержания никотинамидадениндинуклеотида (восстановленного) НАД'Н2 и никотинамидадениндинук-леотидфосфата (восстановленного) НАДФ-Н2 по поглощению света с длиной волны 340 нм, т. е. в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрасной области пригодны кюветы из обычного стекла; для регистрации оптической плотности раствора в ближней ультрафиоле-

товой области нужны кюветы из специальных сортов стекла, так называемого увиолевого, в коротковолновой ультрафиолетовой области годятся только лишь кюветы из кварца и сапфира.

При выполнении фотометрических исследований оценку результатов чаще всего производят тремя способами:

1) по конечной точке (измерение в конечной точке),

2) по фиксированному времени (примером может служить прямой псевдокинетический метод Яффе),

3) кинетическим (кинетическое измерение).

Определение по конечной точке состоит в учете образования продукта за некоторое (порой относительно длительное) время инкубации. Для расчета результатов требуется параллельное проведение стандартной пробы.

Способ исследования по методологии фиксированного времени основан на установлении количества нарабатываемого (расходуемого) продукта за определенный промежуток времени с последующим расчетом концентрации (активности) по стандарту. Он осуществляется на фотометрах с обычными светофильтрами или спектрофотометрах (типа «СОЛАР»), оснащенных термостатированным кюветным отделением.

Кинетический метод исследования, как и предыдущий, является ферментативным. Выполняется с применением строго монохроматизированного светового потока (фотометров с интерференционными светофильтрами или спектрофотометров) и использованием термостати-руемой кюветы (при температуре 25, 30 "С и, чаще всего, 37 °С). После старта реакции через определенный интервал времени (например 60 с троекратно) находят изменение оптической плотности, из полученных значений рассчитывают среднюю величину и с использованием определенных (соответствующих температуре инкубации) коэффициентов производят расчет с выражением результатов в ЕД/л (кат/л) и их производных.

Методы второй и особенно третьей группы обладают рядом существенных преимуществ перед одноточечными (конечной точки): их выполнение занимает мало времени, они не связаны с применением агрессивных жидко-стей, точны, позволяют получать достоверные результаты (в особенности при исследовании активности ферментов, когда, к тому же, не требуется разводить в определенное количество раз сыворотку крови для предотвращения эффекта «разбавления» при гиперферментемии). Подав­ляющее их большинство базируется на использовании оптического теста Варбурга, состоящего в ферментатив­ном (с участием лактатдегидрогеназы) превращении НАД-Нч в НАД (и наоборот), существенно отличающихся величиной оптической плотности при длинах волн 340, 334, 365 нм.

Этот принцип исследования положен, в частности, в основу ферментативного, с участием лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определения пировиноградной (ПВК) и молочной (МК) кислот (по катализируемой этим энзимом прямой и обратной реакции).

При определении содержания разнообразных субстра­тов и метаболитов реакций и активности многих фермен­тов стараются, чтобы они «замыкались» на превращении ПВК в МК (и наоборот) с участием лактатдегидрогеназы и НАД (НАД-Н₂). Так, в методике установления активно­сти аланинаминотрансферазы используются следующие реакции:

-"-*, I

Наряду с ЛДГ находит применение и малатдегидроге-наза (МДГ).

В настоящее время с использованием оптического те­ста Варбурга определяется активность более 100 фермен­тов.

208

Чтобы избежать необходимости осуществлять измерения в ультрафиолетовом световом потоке (что выполнимо лишь с применением специальных дорогостоящих анализаторов), в реакционную смесь добавляют вещество, приобретающее способность излучать свет в видимой области спектра. Образующийся в результате ферментативной реакции НАД-Н2 и НАДФ-Н2 восстанавливают индикатор формазан с образованием окрашенного продукта, количество которого легко определять колориметрически. Примером этого может служить определение активности лактатдегидрогеназы:

В приведенной выше схеме резоруфин (окрашенный продукт) флюоресцирует в 100 раз сильнее НАД-Н2-

Еще более удобны прямые колориметрические методы с использованием тио-НАД (ТНАД-Нз) и тио-НАДФ (ТНАДФ-Н2). При восстановлении этих производных они окрашиваются в желтый цвет и могут быть определены в коротковолновой области спектра (398 нм). Ход ферментативных реакций можно регистрировать методами флюориметрического анализа, в 100—1000 раз более чувствительными, чем колориметрические. Они обычно основаны на собственной флюоресценции пиридинкофер-ментов (НДД-Н2 и НАДФ-Н2). Однако благодаря использованию флюоресцирующих индикаторов (флюоресцен-тной редоксиндикаторной цепи)

Применяя бактериальную люциферазу, можно получить продукт, флюоресценция которого в 1000 раз превышает флюоресценцию НАД -Н2.