13.7. Патогенные вибрионы

13.7.1.1. Классификация и общая характеристика семейства Vibrionaceae

В настоящее время семейство Vibrionaceae включает 8 родов бактерий. Основные патогенные представители относятся к роду Vibrio

Ведущую роль в патологии человека играет возбудитель холеры V. сholerae.

V. рarahaemolyticus является причиной диарейных инфекций, V. vulnificus иногда способен вызывать раневую инфекцию и септицемию.

По морфологии возбудители представляют собой изогнутые подвижные палочки размерами 2-4 мкм. Спор не образуют.

Вибрионы распространены повсеместно: обитают в морской и пресной воде, часто колонизируют организмы водных животных (амфибий, ракообразных, рыб и др.)

Температурный оптимум для многих видов 37°С (некоторые возбудители, обитающие в морской воде, лучше размножаются при температуре 25°С и ниже).

При культивировании вибрионов в среду вносят 2-3% раствор NaCl (галотолерантные микроорганизмы).

Данные бактерии – хемоорганотрофы с окислительным и бродильным типом метаболизма.

Ферментируют глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты, иногда газа. Оксидазоположительны.

13.7.1.2. Возбудители холеры

Заболевание известно с древних времен. До 1817 г. холера вызывала эпидемии в странах Юго-Восточной Азии (в районах рек Ганга и Брахмапутры). С 1817 г. по 1926 г. наблюдалось распространение болезни за пределы эпидемических очагов с развитием пандемий почти на всех континентах.

В 1883 г. Р. Кох открыл возбудителя холеры – классический холерный вибрион. В 1906 г. Ф. Готшлихт на карантинной станции Эль-Тор выделил еще один биовар возбудителя – вибрион Эль-Тор. В течение XIX века было зарегистрировано 6 эпидемий холеры, последняя из которых завершилась в 1923 г.

В 1961 г. развилась 7 пандемия холеры с преобладанием вибриона Эль-Тор. В начале 1993 г. появились данные о вспышках холеры в Юго-Восточной Азии, вызванных вибрионами неизвестной ранее серогруппы О139 (Бенгал). Считается, что этот вариант становится возбудителем 8 пандемии холеры, хотя вибрион Эль-Тор также продолжает выделяться от больных. В частности, он стал причиной эпидемии холеры на Гаити в 2010 г.

Морфология

Холерные вибрионы представляют собой изогнутые палочки размерами 2-4 мкм, имеют один или два полярных жгутика. Вибрионы весьма подвижны.

Спор не имеют. Продуцируют экзополисахарид, который участвует в формировании микробной биопленки. Представители серогруппы О139 образуют капсулу.

Бактерии обладают полиморфизмом. Типичный возбудитель в форме «запятой» обычно наблюдают в образцах клинического материала. В мазках из колоний преобладают палочковидные возбудители. Иногда возникают нитевидные, кокковидные, булавовидные формы. Под действием пенициллина могут превращаться в L-формы.

Хорошо окрашиваются многими анилиновыми красителями, грамотрицательны.

Культуральные свойства

Растут на простых питательных средах в температурном диапазоне 16-40°С, оптимум – 37°С, селективными являются щелочные среды с рН 7,6-9,0.

На жидких средах вызывает помутнение и образование нежной голубоватой пленки на поверхности. На 1% щелочной пептонной воде (рН 8,8-9,0) растут быстро, помутнение и пленка появляется через 6-8 часов.

На твердых средах (щелочной агар) образуют мелкие, прозрачные, с ровными краями, голубоватые в проходящем свете колонии.

На агаре с тиосульфатом, цитратом, солями жёлчных кислот, сахарозой и индикатором бромтимоловым синим (ТЦБС-агар) образуют желтые колонии на фоне голубовато-серой среды. На среде Монсура (щелочной таурохолат-теллурит-желатиновый агар) растут в виде серо-черных колоний.

Биохимические свойства

Факультативный анаэробы с более выраженными аэробными свойствами.

Холерные вибрионы биохимически весьма активны. Ферментируют с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, маннит, крахмал, не разлагают лактозу. По отношению к трем углеводам – маннозе, сахарозе и арабинозе – все вибрионы разделяют на 6 групп по Хейбергу.

Холерные вибрионы разлагают маннозу и сахарозу, не разлагают арабинозу и принадлежат к 1 группе Хейберга.

Проявляют протеолитическую активность: разжижают желатину в виде воронки, гидролизуют казеин. Обладают плазмокоагулирующим и фибринолитическим действием. Свертывают молоко, разлагают белки до индола и аммиака. Восстанавливают нитраты в нитриты.

На основании биологических различий холерные вибрионы разделяют на 2 биовара: классический и Эль-Тор. Особенностью вибриона Эль-Тор является способность гемолизировать эритроциты, в связи с чем его относят к гемолитическим вибрионам. Дифференциальные различия возбудителей холеры представлены в табл. 13.

Таблица 13.

Дифференциальные признаки возбудителей холеры

Признак	V. cholerae, классический биовар	V. cholerae, биовар Эль-Тор	Серогруппа О139
Гемолиз эритроцитов барана	—	+	—
Реакция Фогеса-Проскауэра	± (чаще –)	± (чаще +)	± (чаще +)
Чувствительность к полимиксину В (50ЕД)	+	—	—
Агглютинация куриных эритроцитов	—	± (чаще +)	± (чаще +)
Чувствительность к классическому монофагу	+	—	—
Чувствительность к монофагу Эль-Тор	—	+

Антигенная структура

У холерных вибрионов есть термостабильный О-антиген и термолабильный жгутиковый Н-антиген. Жгутиковый Н-АГ является общим.

По структуре О-АГ выделяют до 200 серогрупп. Оба биовара возбудителей холеры относятся к серогруппе О1.

Было установлено, что О1-АГ неоднороден и состоит из трех субъединиц: А, В, С, по которым различают серовары АВ – Огава, АС – Инаба и АВС – Гикошима. Эти свойства являются эпидемиологическими маркерами данных возбудителей.

Представители серогруппы О139 не агглютинируются О1-сыворотками. Данный вариант произошел от биовара Эль-Тор.

Его возникновение обусловлено генетическими механизмами. В результате рекомбинации возбудитель приобрел группу генов, кодирующих новый вариант ЛПС клеточной стенки совместно с полисахаридом капсулы.

Значительные изменения в строении поверхностных АГ обеспечили «ускользание» бактерий серогруппы О139 от действия факторов иммунитета, направленных к другим возбудителям холеры.

Другие вибрионы, которые также не агглютинируются О1-сывороткой, обозначаются как НАГ-вибрионы (или неагглютинирующиеся). Они способны вызывать самостоятельные диарейные заболевания.

Факторы вирулентности

Возбудитель содержит многочисленные адгезины и факторы колонизации. К ним относятся гемагглютинин и различные виды пилей.

Экзополисахарид вибрионов выполняет защитную функцию и обеспечивает образование биопленки.

Основную роль в патогенезе холеры играет экзотоксин (или холероген) – термолабильный белок, устойчив к действию протеолитических ферментов, разрушается фенолом и формалином. По механизму действия представляет собой энтеротоксин.

Молекула экзотоксина состоит из 2 компонентов (А и В) общей молекулярной массой 84 кД.

Рецепторный компонент В имеет 5 субъединиц. Он взаимодействует с G_М1-ганглиозидным рецептором на энтероцитах и обеспечивает проникновение в клетку токсического компонента А. В клетке происходит восстановление компонента А с образованием субъединицы А₁, которая катализирует рибозилирование клеточного G-белка.

В результате активируется аденилатциклаза, и происходит повышение уровня цАМФ в энтероцитах. Это приводит к активной секреции ионов хлора и бикарбонатов, подавлению всасывания ионов натрия, хлора и воды, выходу жидкости и электролитов из железистых клеток в просвет кишечника с развитием тяжелой диареи.

Образование токсина определяется ctx-генами трансдуцирующего CTXφ -бактериофага. Попадание фага CTXφ в холерный вибрион и его интеграция в геном приводят к лизогенной конверсии возбудителя, и вибрион получает способность к синтезу холерного токсина.

Однако успешная трансдукция фага в бактерии возможна только при наличии у вибрионов особых рецепторных пилей. Они способны специфически связывать CTX-фаг, обеспечивая его проникновение в клетку.

Рецепторные пили кодируются генами отдельного генетического острова патогенности VPI. Предполагается, что данный остров патогенности попадает в холерный вибрион в результате трансдукции еще одного специфического фага VPIφ.

Ферменты агрессии и инвазии гиалуронидаза и нейраминидаза разжижают слизь, облегчают доступ бактерий к эпителию, обеспечивают взаимодействие с микроворсинками.

Полисахарид капсулы бактерий серогруппы О139 защищает от фагоцитоза и предохраняет от действия АТ и комплемента.

Резистентность

Холерные вибрионы устойчивы к низким температурам – во льду жизнеспособны до 1 месяца. В морской воде сохраняются до 1,5-2 месяцев, в речной – до нескольких недель, в почве – до 3 месяцев, в фекалиях – до 3 суток. В вареных продуктах, молоке и молочных продуктах, сырых овощах жизнеспособны 2-5 дней, на фруктах – 1-2 дня.

Вибрионы обладают слабой резистентностью к действию повышенной температуры. При 80°С погибают через 5 мин, при 100°С – мгновенно. Холерные вибрионы высокочувствительны к высушиванию, ультрафиолетовому облучению, хлорсодержащим препаратам; все вибрионы высокочувствительны к кислотам.

Патогенез и характеристика заболевания

Возбудитель является нормальным обитателем водной среды в странах Юго-Восточной Азии, особенно в слабосоленых водах эстуариев и дельт рек, теплой прибрежной морской зоне. Он прикрепляется к зоопланктону, образует биопленку, при этом долго сохраняет жизнеспособность.

В благоприятных условиях при совместном обитании между возбудителями происходит горизонтальный перенос различных генов, включая гены патогенности.

Исходно непатогенный холерный возбудитель приобретает вирулентность после нескольких этапов генетической рекомбинации, в основе которой лежит трансдукция бактериофагов.

Первоначально он приобретает способность к синтезу пилей – специфических рецепторов к CTXφ-бактериофагу. После этого происходит трансдукция CTXφ-фага, содержащего гены экзотоксина-холерогена. После встраивания фага в геном возбудитель холеры становится высоковирулентным.

Холера – это острое антропонозное особо опасное инфекционное заболевание, протекающее с глубокой дегидратацией и деминерализацией (потерей воды и солей) в результате диареи и рвоты.

Болезнь по-прежнему представляет собой серьезную эпидемиологическую угрозу, особенно для развивающихся стран. Во время эпидемии 2010-2011 г.г. после землетрясения на Гаити и в сопредельных странах заболело более 250 тыс. человек, из них более 4500 умерло. Летальность составила около 2%. При этом среди госпитализированных больных с тяжелым течением заболевания летальность может быть существенно выше.

Отдельные случаи заболевания регистрируются на территории СНГ (вспышка на Украине 2011 г.)

Резервуар и источники инфекции – больные и бактерионосители.

Основной механизм заражения – фекально-оральный, который реализуется водным, алиментарным и контактно-бытовым путями. Определенную роль играют мухи, способные переносить возбудителя с испражнений на пищевые продукты.

Ведущим путем передачи, приводящим к эпидемиям, является водный. Заражение происходит как при питье инфицированной воды, так и при использовании ее для мытья овощей, фруктов и во время купания. Недостаточная термическая обработка продуктов приводит к заражению. Как и при других кишечных инфекциях, заболеваемость холерой увеличивается в летне-осенний период.

Инфицирующая доза для возбудителя холеры биовара Эль-Тор при заражении через воду высока – 10⁶-10¹⁰ микробных клеток. Однако при алиментарном заражении, особенно для лиц с пониженной кислотностью желудочного сока, с анацидными гастритами доза возбудителя существенно ниже – 10²-10⁴ бактерий.

Попадающие через рот с водой или пищей холерные вибрионы в большинстве своем погибают под действием кислой среды желудка. Оставшиеся возбудители проникают в тонкую кишку, локализуются в просвете кишечника и прикрепляются к микроворсинкам эпителия при помощи адгезинов.

Выделение эпителиальными клетками щелочного секрета, высокое содержание пептонов и желчи способствуют интенсивному размножению холерного вибриона и продукции экзотоксина. При этом холера – неинвазивная инфекция. Возбудитель внутрь клеток не проникает и воспалительная реакция не развивается.

Действие выделяемого вибрионом экзотоксина приводит к гиперсекреции ионов хлора, других электролитов и воды из энтероцитов в просвет тонкой кишки. Наряду с этим снижается реабсорбция воды в толстом кишечнике. Это обусловливает основные клинические проявления холеры: водянистую диарею и рвоту. В результате обезвоживания и нарушения электролитного баланса развиваются гиповолемия со сгущением крови и нарушением микроциркуляции, что приводит к артериальной гипотензии, сердечной недостаточности, нарушению сознания и гипотермии.

Инкубационный период колеблется от нескольких часов до 5 дней (в среднем 2-3 дня). Заболевание может развиваться в типичной и атипичной формах.

При типичном течении в зависимости от степени дегидратации различают легкую, среднетяжелую и тяжелую формы холеры. В типичных случаях болезнь развивается остро, часто внезапно. Появляются позывы на дефекацию, диарея (от 3 до 15-20 раз в сутки) и рвота. Стул обычно обильный, водянистый, напоминает «рисовый отвар». Рвота «фонтаном», без тошноты, многократная, с примесью желчи. В тяжелых случаях человек теряет до 30 л воды в сутки, температура тела снижается до 35-34°С (холерный алгид – от лат. аlgus – холодный).

Отмечается характерное появление facies hippocratica (запавшие глаза с заостренными чертами лица). При отсутствии лечения летальность больных в алгидной стадии достигает 60%.

В современных условиях большинство случаев холеры вызваны вибрионом Эль-Тор и протекают в легкой форме. Соотношение тяжелых поражений к количеству легких, стертый форм для классической холеры составляет 1:5-10, для холеры Эль-Тор 1:25-100.

Иммунитет

После перенесенного заболевания прочный, длительный, повторные случаи наблюдаются редко. Он обусловлен антитоксическими и антимикробными антителами, клетками иммунной памяти и фагоцитами.

Лабораторная диагностика

Основной метод – бактериологический. С учетом эпидемиологической опасности заболевания идентификация возбудителя должна происходить в максимально короткие сроки.

Целью исследований является выявление больных и бактерионосителей, контроль за эффективностью лечения больных и санация носителей, контроль над объектами внешней среды и эффективностью дезинфекционных мероприятий.

Материалы для исследований – испражнения, рвотные массы, желчь, секционный материал, вода, смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты и др.

Материал следует доставлять в лабораторию не позже 2 ч после забора. При невозможности образцы помещают в транспортные среды (наиболее пригодна 1% пептонная вода с рН 8,2-8,6). Для посева используют жидкие среды обогащения, щелочной МПА, элективные среды (ТЦБС-агар и др.)

Срок роста на щелочной пептонной воде 6-8 ч, на щелочном агаре не менее 14-16 ч, на элективных плотных средах 18-24 ч.

Исследование больных, бактерионосителей и трупного материала проводят в несколько этапов.

Первоначально материал засевают на накопительную среду (например, щелочную пептонную воду), на щелочной агар или среду ТЦБС).

После инкубации в течение 6-8 часов на щелочной пептонной воде образуется пленка микроорганизмов. Из нее готовят препараты для нативной микроскопии и окраски по Граму. Обнаруживают грамотрицательные вибрионы, обладающие выраженной подвижностью. Ставят тест на оксидазу, который должен быть положительным. Проводят реакцию агглютинации с О1-и О139-сыворотками в титре 1/100. При наличии агглютинации дают предварительный положительный ответ о выделении возбудителя.

Из материала среды производят высев на щелочной агар и вторую среду накопления. Если при исследовании материала ускоренными методами (микроскопия, агглютинация О1-сывороткой) получают положительные результаты, пересев на другую среду накопления не производят.

Далее из чашек с ростом возбудителей отбирают для исследования не менее 5 подозрительных колоний. При этом на среде ТЦБС образуются колонии желтого цвета вследствие разложения сахарозы. Проверяют морфологию бактерий, проводят оксидазный тест. Подозрительные колонии исследуют в реакции агглютинации на стекле с О1-антисывороткой, с сыворотками Инаба и Огава в разведении 1:50-100, а также холерной сывороткой О139.

Материал колоний пересевают для выделения чистой культуры на скошенный щелочной агар или среды с сахарозой и индикатором. Затем проводят серологическую и биохимическую иидентификацию выросших микроорганизмов, дифференцируют биовары возбудителей холеры по специфическим тестам, включая фаготипирование.

Для ускоренной идентификации возбудителей можно применять метод иммунной флюоресценции.

Лечение

Основным направлением в лечении является немедленное восполнение дефицита воды и электролитов. Адекватная регидратация и реминерализация солевыми растворами с глюкозой, заместительная инфузионная терапия позволяют стабилизировать состояние больных и приводят к выздоровлению.

Антибактериальную терапию проводят препаратами тетрациклинового ряда. Можно использовать хлорамфеникол, фторхинолоны.

Профилактика

С целью специфической профилактики используются вакцины.

Вакцина холерная корпускулярная инактивированная сухая представляет собой взвесь равных количеств холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, классических или Эль-Тор биоваров, выращенных на плотной питательной среде и инактивированных нагреванием или формалином. Препарат предназначен для активной профилактики холеры у взрослых и детей с 2-х-летнего возраста по эпидемическим показаниям.

Вакцина холерная (холероген-анатоксин в сочетании с О-антигеном) представляет собой препарат, полученный из культуры холерного вибриона 569 В серовара Инаба, инактивированный формалином. Основным действующим началом является холероген-анатоксин и соматический О-антиген. Препарат предназначен для создания активного иммунитета против холеры с 7-летнего возраста по эпидемическим показаниям.

Данные вакцины обеспечивают развитие иммунитета у 50-80% привитых продолжительностью до 6-12 мес.

С учетом недостаточной эффективности и короткого срока действия имеющихся вакцин, в настоящее время разрабатываются препараты на основе живых аттенуированных штаммов возбудителя.

Неспецифические санитарно-гигиенические мероприятия направлены на предупреждение заноса холеры из неблагополучных районов, раннее выявление больных и носителей, эпидемиологический надзор за источниками водоснабжения, контроль за соблюдением санитарно-гигиенических норм на предприятиях пищевой и молочной промышленности, торговли и т.п.