XI. Аэробные неферментирующие грамотрицательные палочки и коккобактерии

Аэробные неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ) являются одной из ведущих причин госпитальных (нозокомиальных) инфекций во всем мире. Эти возбудители являются типичными оппортунистическими патогенами. Они вызывают развитие наиболее тяжелых гнойно-воспалительных осложнений у больных, находящихся на стационарном лечении, в первую очередь, в отделениях реанимации и интенсивной терапии, ожоговых отделениях и хирургических отделениях различного профиля.

Клиническая значимость НГОБ обусловлена главным образом их крайней устойчивостью к действию большинства современных антибиотиков и антисептиков. При этом они обладают широким спектром факторов вирулентности.

Повышенная способность к адгезии с образованием биопленок обеспечивает размножение данных возбудителей на любых естественных и искусственных поверхностях, включая медицинские катетеры, имплантаты, протезы, стеклянные или пластиковые емкости для растворов и т.д. Бактерии могут передаваться при контактах между пациентами или медперсоналом через руки, предметы обихода, инструментарий. При достаточной влажности они сохраняют способность к размножению даже в условиях дефицита питания.

Микроорганизмы, входящие в эту группу, обладают рядом общих признаков. Еще сравнительно недавно многие из них относились к общему роду Pseudomonas. Развитие методов генетической таксономии привело к разделению данных возбудителей на новые семейства и роды.

В настоящее время к основным возбудителям группы «неферментирующих бактерий» относят представителей родов Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter, Stenotrophomonas.

Свое название они получили из-за неспособности ферментировать глюкозу и другие углеводы, так как являются строгими аэробами с окислительным типом метаболизма. Тем не менее, они обладают развитыми метаболическими системами и способны окислять многие органические соединения с получением энергии. Отсюда данные возбудители широко распространены в природе, где занимают различные экологические ниши.

Наибольшую угрозу в качестве возбудителя госпитальных инфекций продолжает представлять Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка). Этот микроорганизм вызывает до 10-15% от всех госпитальных инфекций.

11.1. Псевдомонады

Классификация

Род Pseudomonas относится к семейству Pseudomonadaceae. Известно более 100 видов псевдомонад, в основном это свободноживущие микроорганизмы. Для человека патогенна P. aeruginosa, иногда оппортунистические инфекции вызывают P. putida, P. fluorescens, P. stutzeri и др.

Морфология

Грамотрицательная палочка, средних размеров, прямая или слегка изогнутая, подвижная (имеет один или два жгутика, расположенных полярно по полюсам), не имеет спор.

Многие штаммы продуцируют большое количество капсулоподобной слизи, состоящей из экзополисахарида альгината. Этот слой рыхло связан с телом бактериальной клетки.

Культуральные свойства

Нетребовательны к условиям культивирования, хорошо растут на простых питательных средах.

Образуют несколько типов колоний. Мукоидные колонии, окруженные внеклеточной слизью, характерны для наиболее вирулентных штаммов.

Вырабатывают водорастворимый феназиновый сине-зеленый пигмент пиоцианин с характерным запахом жасмина, в кислой среде пигмент красный. Пигмент дает флюоресценцию в ультрафиолетовых лучах. Также образуют зеленый пигмент пиовердин, некоторые штаммы продуцируют красный пигмент пиорубин или черный – пиомеланин.

В качестве дифференциально-диагностической среды используют агар с ацетамидом. Синегнойная палочка способна расти и утилизировать ацетамид при 42^оС, что отличает ее от других псевдомонад.

В качестве селективных сред применяют среды с антибиотиками и антисептиками.

Биохимические свойства

Синегнойная палочка является строгим аэробом, имеет окислительный тип метаболизма.

Окисление глюкозы в аэробных условиях до глюконовой кислоты определяют на жидкой среде Хью-Лейфсона.

Оксидазный и каталазный тесты положительны.

Обладает выраженной протеолитической активностью, разжижает желатин, гидролизует казеин. Не образует индола и сероводорода.

Восстанавливает нитраты в нитриты.

Антигенная структура

Имеет соматический О-антиген и жгутиковый Н-антиген.

Группоспецифический О-АГ представлен липополисахаридными и белковыми фракциями, по нему выделяют более 20 серогрупп.

Типоспецифический белковый Н-АГ представлен различными вариантами флагеллинов.

Механизмы и факторы патогенности

Синегнойная палочка выделяет многочисленные токсины и ферменты патогенности.

Возбудитель обладает несколькими специализированными системами секреции белков патогенности (II и III типов). Эти системы обеспечивают активную доставку факторов вирулентности в пораженные клетки.

Экзотоксин А угнетает синтез белка в клетках. По молекулярной структуре и механизму действия имеет сходство с дифтерийным экзотоксином – блокирует клеточный фактор элонгации 2 путем его рибозилирования.

Экзотоксины ExoU (фосфолипаза), ExoY (аденилатциклаза) ExoS и ExoT (рибозилтрансферазы) блокируют расхождение эпителиальных клеток после их деления (цитокинез), что препятствует заживлению раневой поверхности. Направленный транспорт этих токсинов в клетки происходит по механизму III типа секреции.

Гемолизины (фосфолипаза С и липаза) вызывают высвобождение медиаторов воспаления, повреждая мебраны лейкоцитов; приводят к некротическим изменениям в паренхиматозных органах

Эластаза, коллагеназа и протеазы гидролизуют компоненты соединительной ткани (коллаген, эластин, ламинин), белки плотных межклеточных соединений, способствуя микробной адгезии и инвазии. Также они разрушают белки системы комплемента, лизоцим, иммуноглобулины.

Нейраминидаза гидролизует нейраминовую кислоту.

Сигнальные белки P. aeruginosa подавляют продукцию цитокинов пораженными клетками, что затрудняет элиминацию возбудителя.

Токсические свойства микроба связаны с наличием эндотоксина – ЛПС клеточной стенки.

Бактерии продуцируют комплекс биологически активных продуктов, обеспечивающих их неорганическим фосфором (фосфолипазы) и железом (сидерофоры, нарушающие связывание железа трансферрином).

Адгезины обеспечивают прикрепление возбудителей к различным клетками и тканям.

Экзополисахарид капсулоподобного вещества защищает микробы от фагоцитоза. Кроме того, он участвует в адгезии и образовании на различных поверхностях биопленки (микробного сообщества) после колонизации их синегнойной палочкой.

Образование биопленки приводит к резкому увеличению резистентности бактерий к влиянию внешней среды, действию факторов иммунитета, антибиотиков и антисептиков. Для подавления микроорганизмов в составе биопленки требуется повышение концентрации наиболее активных антибиотиков на 2-3 порядка.

Нахождение микробного сообщества в составе биопленки активирует у псевдомонад систему межклеточной сигнализации (или quorum sensing). В этом случае бактерии начинают выделять специфические сигнальные молекулы (гомосеринлактон и его производные, феназиновые пигменты и др.). Под их влиянием в биопленке происходит одновременное усиление продукции факторов вирулентности многими микробными клетками. Это позволяет бактериям преодолеть защитные барьеры органов и тканей, подавить активность местного иммунитета и увеличить свою выживаемость.

Наконец, P. aeruginosa обладает развитыми клеточными структурами, обеспечивающими ее множественную природную устойчивость к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам.

ЛПС наружной мембраны мало проницаем для β-лактамных антибиотиков. Их поступление происходит через пориновые каналы. Мутации белков-поринов приводят к нарушению транспорта β-лактамов (в том числе карбапенемов) в бактериальные клетки.

Важным механизмом антибиотикорезистентности у псевдомонад являются системы обратного транспорта (или эффлюкса) химиопрепаратов. Существует по крайней мере 4 таких системы, которые обеспечивают активное выведение неродственных групп антибиотиков: β-лактамов, фторхинолонов, аминогликозидов, тетрациклинов. По структуре представляют собой регулируемые каналы, через которые происходит удаление химиопрепаратов за пределы микробной клетки.

Кроме того, P. aeruginosa продуцирует ферменты β-лактамазы, кодируемые хромосомными и плазмидными генами. Среди них обнаружены металло-бета-лактамазы, которые обеспечивают устойчивость ко всем β-лактамным антибиотикам, включая карбапенемы.

Резистентность

Представители рода Pseudomonas широко распространены в природе, их обнаруживают в почве, воде, воздухе, выделяют из растений и организмов животных. Они могут являться компонентом нормальной микрофлоры тела человека. Бактерии локализуются на коже в местах богатых потовыми и сальными железами, на слизистой носоглотки, в желудочно-кишечном тракте и т.д. До 10% здоровых людей могут быть в норме колонизированы псевдомонадами.

P. aeruginosa является устойчивым микроорганизмом. В водопроводной воде сохраняется до 2,5 месяцев, в инфицированной пыли выживает до 3-х суток, на поверхности инфицированных рук в течение одного часа, в дистиллированной воде – до одного года. Может сохранять жизнеспособность в растворах антисептиков – риванола, фурацилина и др.

Тем не менее, возбудитель чувствителен к хлорсодержащим дезинфектантам, 2% раствору фенола. Легко инактивируется при нагревании и автоклавировании.

Патогенез и характеристика заболеваний

Несмотря на наличие большого набора факторов вирулентности, синегнойная палочка является оппортунистическим патогеном. Заболевания редко возникают у лиц с нормальной резистентностью с неповрежденной кожей и слизистыми оболочками.

Синегнойная инфекция относится к сапронозам, т.е. возбудитель накапливается на объектах внешней среды, где создается резервуар инфекции, обусловливающий эпидемиологическую опасность.

Возникновению внутрибольничной инфекции способствует несоблюдение режимов стерилизации и дезинфекции инструментов и аппаратуры, применение инфицированных лекарственных средств (глазные капли, мази), использование неэффективных дезинфектантов и антисептиков.

В стационарах циркулируют штаммы синегнойной палочки с повышенной вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью к антибиотикам и антисептикам.

Источники госпитальной инфекции – пациенты и носители возбудителей, включая медперсонал.

Основные механизмы передачи – контактный и аэрогенный. Важную роль в передаче возбудителя играют медицинские вмешательства (установка на длительный срок сосудистых и мочевых катетеров, проведение искусственной вентиляции легких и т.д.)

Существует несколько групп лиц, у которых наиболее высока вероятность развития инфекции.

Во-первых, это пациенты ожоговых и хирургических отделений, урологических и глазных отделений, отделений реанимации и интенсивной терапии. У данных лиц нарушена целостность кожных покровов и слизистых. При этом возможен их длительный контакт с возбудителем.

Другую группу составляют лица с выраженной иммуносупрессией и нейтропенией – пациенты после трансплантации, онкологические больные после химиотерапии, ВИЧ-инфицированные и др. Чувствительными к инфекции являются пациенты с трофическими нарушениями, например, больные сахарным диабетом.

Особую группу лиц, у которых возникает тяжелая легочная синегнойная инфекция, составляют больные муковисцидозом (наследственным аутосомно-рецессивным заболеванием с нарушением мукоцилиарного транспорта и поражением легких).

Инфекционный процесс начинается с адгезии возбудителя к покровным тканям. Особенно выражены адгезивные свойства к эпителию дыхательных путей и роговицы глаза.

Для эффективной колонизации обязательным условием является наличие раневой или ожоговой поверхности, повреждений кожи или слизистых, в легких – нарушение мукоцилиарного клиренса.

При помощи пилей и экзополисахарида происходит связывание бактерий с доступными гликопротеинами соединительной ткани. В дыхательных путях экзополисахариды бактерий взаимодействуют со слизью и муцином, образуя биопленку. Подобное происходит при муковисцидозе, при этом у больных высевают мукоидные штаммы возбудителей.

Выделяемые псевдомонадами токсины и ферменты повреждают эпителий, разрушают соединительнотканные барьеры и межклеточные соединения, обеспечивая дальнейшую инвазию возбудителя. Факторы вирулентности подавляют локальный иммунный ответ и тормозят тканевую регенерацию. Экзополисахарид защищает бактерии от фагоцитоза.

Синегнойная палочка вызывает раневую инфекцию любой локализации, катетер-ассоциированные инфекции, циститы, отиты, менингиты, остеомиелит, абсцессы внутренних органов, генерализованную инфекцию (сепсис).

P. aeruginosa является ведущим возбудителем госпитальных пневмоний у лиц, находящихся на искусственной вентиляции легких (вентилятор-ассоциированные пневмонии или ВАП).

Летальность при синегнойном сепсисе и ВАП достигает 40-50%. Трудности лечения определяются множественной лекарственной устойчивостью возбудителей.

Иммунитет при данной инфекции обусловлен клеточными и гуморальными факторами. Основным защитным механизмом является фагоцитоз возбудителей нейтрофилами. Антитела участвуют в опсонизации бактерий, препятствуют их адгезии и распространению.

Лабораторная диагностика

Материал для исследования зависит от локализации процесса: раневое отделяемое, пунктат абсцесса, гной, кровь, мокрота, моча.

Микроскопический метод имеет ориентировочное значение, обнаружение грамотрицательных неспорообразующих подвижных палочек позволяет правильно подобрать питательные среды.

Бактериологический метод: делают посев материала на среду с ацетамидом, селективные среды, проводят тест Хью-Лейфсона. P.aeruginosa растет при 42°С и не растет при 5°С.

На средах учитывают образование сине-зеленого водорастворимого пигмента пиоцианина и делают мазки из колоний слизистой консистенции.

Далее проводят тест на оксидазу и каталазу, которые у P. aeruginosa должны быть положительны. Поскольку данная бактерия – строгий аэроб, то он разлагает глюкозу в аэробных условиях и не разлагает в анаэробных условиях. Также возбудитель разжижает желатин, не выделяет индол, восстанавливает нитраты в нитриты.

Проводится определение антибиотикоустойчивости возбудителей.

Для обнаружения ДНК возбудителя в материале возможно применение ПЦР-диагностики.

Серодиагностика не используется.

Фаготипирование и пиоцинотипирование проводят по эпидпоказаниям.

Таблица

Основные дифференцирующме признаки флюоресцирующих псевдомонад

Тест или субстрат	Вид
	P.aeruginosa	P. fluorescens	P. putida
Цитохромоксидаза	+	+	+
Пигмент пиоцианин	+	-	-
Флюоресценция	+	+	+
Глюкоза	+	+	+
Рост на ацетамидном агаре	+	-	+
Рост при 50С	-	+	-
Рост при 420С	+	-	-
Желатиназа	+	+	-

Лечение

Основным этиотропным методом лечения синегнойной инфекции является массивная антибиотикотерапия. Используются комбинации препаратов, в отношении которых возбудитель проявляет наименьшую устойчивость. Выбор очень сложен, поскольку даже к карбапенемам P. aeruginosa может быть резистентна в 30-40% случаев. Возбудитель сохраняет высокую чувствительность только к представителям группы полимиксинов.

Для лечения карбапенемы применяются в комбинации с фторхинолонами (левофлоксацином). Также назначаются антисинегнойные цефалоспорины (цефепим, цефоперазон), комбинированные β-лактамы, аминогликозиды (амикацин).

Для терапии инфекции, устойчивой ко всем данным антибиотикам, используют полимиксин В. Применение препаратов этой группы ограничено в связи с высокой токсичностью. Их можно использовать при местном лечении.

Иногда для специфической иммунотерапии тяжело протекающих инфекций назначают антисинегнойную гипериммунную плазму или специфический гамма-глобулин.

Попытки иммунопрофилактики синегнойной инфекции вакцинами и анатоксинами у пациентов с обширными травматическими повреждениями мягких тканей и внутренних органов, с обширными послеоперационными ранами, ожогами, находящихся на искусственной вентиляции легких, пока не принесли убедительных результатов.