Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции раны
Возбудители - C. perfringens, С. novyi, С. septicum, С. histolyticum, С. difficile и др. Материалом для исследования служат кусочки пораженной и некротизированной ткани, жидкость отеков, кровь. При пищевых токсикоинфекциях, вызванных клостридиями, исследуют рвотные массы, промывные воды желудка, кал.
Используют микроскопический, бактериологический и биологический методы исследования.
Микроскопический метод. Готовят мазки - отпечатки из патологического материала, окрашивают по Граму и Бури-Гинсу. При обнаружении в мазках по Граму большого количества грамположительных грубых или полиморфных палочек, а при окраске по Бури-Гинсу капсул можно предположить, что у больного газовая анаэробная инфекция. Используют также люминесцентную микроскопию. Мазок-отпечаток обрабатывают иммунофлуюоресцентной видоспецифической сывороткой и изучают в люминесцентном микроскопе. Вокруг микробных клеток обнаруживают желто-зеленое свечение.
Бактериологический метод. Патологический материал растирают в ступке с кварцевым песком и готовят 10% гомогенат на физиологическом растворе. Делят его на 2 части. Первую часть гомогената прогревают на водяной бане при температуре 80ºС в течение 20-30 минут для уничтожения вегетативной микрофлоры. Жидкость из отека и кровь центрифугируют 30 минут при 3000 об. мин. Для посева используют осадок.
Исследуемый материал высевают на следующие питательные среды: кровяной агар Цейсслера, желточный агар, в глубину столбика висмут - сульфит агара, на бензидиновый агар, среду Виллиса-Хоббса, СКС, в 5 пробирок со средой Китта-Тароцци, 4 из которых перед посевом кипятят в течение 20 минут, а затем быстро охлаждают. 1 пробирка остается без прогрева. Целесообразно засевать материал для исследования в мясопептонный агар и сахарный агар, которыми заполняют пастеровские пипетки. Посевы помещают в анаэростаты и ежедневно наблюдают рост на плотных питательных средах. Посевы в жидких питательных средах выращивают в обычных условиях в термостате в течение 15 суток.
Например, на кровяном агаре Цейсслера C. perfgringens вырастают в виде плоских колоний с возвышением в центре и зоной полного гемолиза. Этот вид возбудителя склонен к ползучему росту. В столбике агара образуют дискообразные колонии. На желточном агаре вокруг колонии C. perfgringens образуется кольцо белого цвета (C. perfgringens вырабатывают лецитиназу-С). Выросшие колонии микроскопируют и при наличии в мазках грамположительных полиморфных грубых палочек пересевают на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры. Микроскопируют также материал из жидких питательных сред, где наблюдается помутнение среды и выделение пузырьков газа, и пересевают его на указанные выше плотные среды для получения роста отдельных изолированных колоний и выделения чистых культур.
Чистую культуру анаэробных микробов идентифицируют на основе:
1) морфологических и тинкториальных свойств (готовят мазки, окрашивают по Граму для выявления грубых или полиморфных грамположительных палочек, среди которых могут встречаться споровые формы);
2) подвижности (готовят препарат «висячая капля»);
3) биохимических свойств (засевают в среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой, сахарозой, глицерином, салицином, а также лакмусовым молоком, желатином, свернутой сывороткой, изучают лецитиназную активность на желточном агаре, ставят пробу на каталазу;
4) аэротолерантности (высевают чистую культуру на сектор кровяного агара и культивируют 24-48 часов при 37°С в аэробных условиях).
Вид выделенного возбудителя раневой анаэробной инфекции определяют с помощью биопробы на мышах путем нейтрализации токсинов специфическими противогангренозными сыворотками. С этой целью используют центрифугат 24 часовой культуры, выросшей на среде Китта-Тароцци, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают 40 минут при 20°С в темном месте для нейтрализации токсина и вводят двум мышам по 0,5 мл внутривенно. Результаты биологической пробы учитывают через 3 суток по действию гомологичной антитоксической сыворотки, которая нейтрализует токсин и не вызывает гибель животных.
Выделенную культуру микробов изучают путем люминесцентной микроскопии на способность продуцировать токсин. На предметное стекло с микробами наносят каплю акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом и исследуют в иммерсионной системе люминесцентного микроскопа. Если культура токсигенная - палочки зеленого цвета. Палочки красного цвета или зеленого с красными участками указывают на слабую токсигенность или её отсутствие.
Биологический метод. Исследуемый материал, взятый от больного с подозрением на раневую газовую анаэробную инфекцию, вводят внутримышечно или внутрибрюшинно белым мышам или морским свинкам. У зараженных животных при наличии анаэробов развивается картина анаэробной инфекции.