Микробиологическая диагностика ботулизма

Возбудитель - Clostridium botulinum входит в семейство Bacillaceae, род Clostridium.

     Материалом для микробиологического исследования являются рвотные массы, промывные воды желудка, кал, кровь, моча, остатки пищевых продуктов. При летальном исходе исследуют содержимое желудка, кишечника, лимфатические узлы, головной и спинной мозг.

     Используют методы микробиологической диагностики: бактериологический, биологический (для выявления ботулотоксина в исследуемом материале).

     С целью выявления ботулотоксина можно использовать также РОПГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антитоксинами соответствующих типов) и определение активности фагоцитов (ботулинический токсин способен подавлять активность фагоцитов, которая восстанавливается в присутствии соответствующей антитоксической сыворотки).

     Бактериологический метод. Исследуемый материал растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором хлорида натрия.

     Посев материала выполняют на специальные питательные среды, например, среду Китта-Тароцци.

     Одну пробу засевают в 4 пробирки, две из которых прогревают при температуре 60°С 15 мин. (для селекции C. botulinum типа Е), а остальные - при температуре 80°С 20 мин. Накопление культур клостридий типа Е и F происходит при температуре 28°С, типа А, В, С - при 35°С в течение 48 часов.

     Через 24-48 часов выдержки посевов в термостате отмечают характер роста на среде Китта-Тароцци: помутнение, газообразование. Готовят мазки, окрашивают по Граму. В случае выявления типичных клостридий с терминально расположенными спорами овальной формы в виде «теннисной ракетки» делают пересев на кровяной сахарный агар для получения отдельных колоний и выделения чистой культуры.

     Для идентификации чистой культуры возбудителя определяют сахаролитические и протеолитические свойства. Антигенные свойства изучают в реакции агглютинации с типовыми сыворотками. Одновременно с изучением ферментативных свойств возбудителя выявляют ботулотоксин в фильтрате бульонной культуры и определяют его тип в реакции нейтрализации.

     Биологический метод. Выявление ботулотоксина и определение его типа с помощью реакции нейтрализации имеет важное значение для назначения специфической терапии.

     Для проведения реакции нейтрализации используют сухие диагностические антитоксические сыворотки типов А, В, С, Е, F, которые разводят физиологическим раствором до 100-200 МЕ / мл, что обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе.

     Реакцию нейтрализации проводят либо со смесью сывороток (предварительная реакция), либо с моновалентными сыворотками для определения типа токсина.

     

Сахаролитические и протеолитические свойства Clostridium botulinum типов А, В, С, D, Е, F

   

     Условные обозначения:

     КГ - образование кислоты и газа

     (КГ) - кислота и газ не у всех штаммов

     + - разжижение или пептонизация, положительная реакция

     (+) - медленная реакция 

     

     Подготовленный для исследования материал (в виде фильтрата, центрифугата или крови) разливают по 1 мл в 6 пробирок. В первые пять пробирок добавляют по 1 мл противоботулинической сыворотки типов А, В, С, Е, F соответственно, а в последнюю - 1 мл нормальной сыворотки. Пробирки инкубируют в термостате в течение 30 мин. Через 30 мин. шести парам белых мышей вводят по 1 мл смеси из каждой пробирки (кровь - внутрибрюшинно, а другие материалы - подкожно). Заболевание характеризуется появлением учащенного дыхания, расслаблением мышц брюшной стенки («осиная талия»), судорогами, параличом, смертью животного. Мыши, которым был введен центрифугат с противоботулинической сывороткой, остаются живыми.

     Если в исследуемом материале есть ботулинический токсин, выживает только одна пара мышей, у которых произошла нейтрализация ботулинического токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа.

     Определение фагоцитарного показателя. Ботулинический токсин подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов. Это свойство используют для выявления его в крови больных и в пищевых продуктах. Исследования проводят следующим образом: кровь больного смешивают в пробирке с 3% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1. Опыт выполняют в двух пробирках с использованием поливалентной противоботулинической сыворотки. Если используют типовые сыворотки А, В, С, Е, F, соответственно, количество пробирок для исследования увеличивается. После смешивания взятых ингредиентов, пробирки помещают в термостат на 30 минут для нейтрализации токсина. В пробирки вносят по одному объему 2 млрд. суспензии Staphylococcus aureus и снова помещают в термостат на 20 минут для завершения фагоцитоза. После этого из содержимого каждой пробирки готовят мазок, фиксируют, окрашивают азурэозином и определяют фагоцитарный показатель (фагоцитарный показатель - количество стафилококков, поглощенных в среднем одним лейкоцитом. Для его определения подсчитывают микроорганизмы в 50 лейкоцитах и полученное число делят на 50.

     Если в крови больного содержится ботулинический токсин, фагоцитарный показатель крови будет низким, за исключением фагоцитарного показателя той порции, в которой тип токсина соответствует типу добавленной в нее сыворотки, то есть произойдет реакция нейтрализации токсина соответствующими антителами, и фагоцитарный показатель будет значительно выше.

     РОПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Сущность реакции заключается в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами, и гемагглютинация происходит при наличии в исследуемом материале антигена. Ее высокая чувствительность и специфичность позволяет найти в исследуемом материале микро количество токсинов. Диагностический титр 1:10.