1. Принцип метода определения белка в сыворотке крови, анализ полученных данных.

Принцип биуретовой реакции: белки в щелочной среде реагируют с сульфатом меди, вследствие чего образуются комплексные соединения, окрашивающие раствор в фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию Б в сыворотке. Для анализа могут использоваться как сыворотка, так и плазма. Из-за присутствия фибриногена, уровень общего белка в плазме на 2–4 г/л выше, чем в сыворотке. Следует с контролировать результаты реакции у пациентов с гипербилирубинемией, липемией, гемолизированной сывороткой (Hb тоже Б) и принимаемыми ЛС, кот. могут вступить в контакт с реактивом. Расчет ведут по калибровочному графику.

Оценка: В норме содержание общего белка в сыворотке крови составляет у детей до года = 48,0 — 76,0 г/л, у детей до 16 лет = 60,0 — 80,0 г/л, у взрослых = 65,0 — 85,0 г/л. Общий белок сыворотки крови является лабораторным показателем, отражающим состояние гомеостаза. Белки сыворотки крови поддерживают вязкость и текучесть крови и формируют ее объем в сосудистом русле, а концентрация белка обеспечивает плотность плазмы крови, что позволяет форменным элементам удерживаться во взвешенном состоянии. Белки сыворотки крови осуществляют транспортные и защитные функции, участвуют в регуляции кислотно-щелочного состояния организма, являются регуляторами свертываемости крови и антителами.

Относительная гиперпротеинемия связана с уменьшением содержания воды в сосудистом русле, к чему могут приводить следующие состояния: тяжелые ожоги; непроходимость кишечника; неукротимая рвота; профузный понос; несахарный диабет; хронический нефрит; усиленное потоотделение.

Абсолютная гиперпротеинемия - увеличение общего белка в сыворотке крови может быть связано с синтезом патологических белков, повышением синтеза иммуноглобулинов или усиленном синтезе белков острой фазы воспаления.

Относительная гипопротеинемия связана с увеличением объема воды в кровеносном русле и наблюдается при: водной нагрузке («водном отравлении»); анурии; олигурии; внутривенном введении больших количеств раствора глюкозы больным с нарушенной выделительной функцией почек; повышенной секреции в кровь антидиуретического гормона гипоталамуса - гормона, способствующего задержке воды в организме.

Абсолютная гипопротеинемия связана с гипоальбуминемией и возникает при: недостаточном поступлении белка в организм (голодание, недоедание, сужение пищевода, нарушение функции ЖКТ); подавлении биосинтеза белка, с воспалит. процессами в печени; врожденных нарушениях синтеза отдельных белков крови; повышенном распаде белка; повышенной потере белка.

2. Принцип метода электрофореза, практическое применение метода.

ЭФ – физический процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле постоянного тока.

Принцип: Белковая смесь, помещенная на носителе в электрическое поле разделяется в зависимости от заряда белков:

• «+» заряженные Б движутся в сторону катода

• «-» заряженные Б движутся в сторону анода

• чем больше плотность заряда, тем быстрее двигаются Б, и наоборот

Поэтому основную роль играет суммарный заряд белковой молекулы. Он определяется соотношением «+» и «-» зарядов радикалов диссоциированных аминогрупп; заряд простетической группы (для сложных белков); рН среды – от него зависит кол-во диссоциированных групп.

Вследствие того, что в процессе ЭФ выделяется тепло, которое вызывает денатурацию Б, используют спец. носители:

• полоску пористой бумаги

• плёнка ацетата целлюлозы

• гелевые поддерживающие среды на стеклянных пластинках (полиакриламидные, крахмальные, агарозные)

После разделения компонентов белковой смеси их можно проявить с помощью спец. методов окрашивания.

Методы ЭФ:

• разделение белков по размеру – ПААГ (Б, близкие по подвижности, но разные по размеру, будут по разному тормозиться – эффект «сита»; причем по мере уменьшения пор в ПААГ будет замедляться движение белков с определенным размером и в опред. точке движение прекратится)

• разделение белков по молекулярной массе – ДСН = додецилсульфат натрия (ДСН – ионный детергент, т.е. при нагревании белковой смеси с ДСН в присутствии восстанавливающего агента (меркаптоэтанола) разрушаются дисульфидные связи и ДСН связвается с полипепт. цепью  нативная структура Б разрушается/ Б с четвертичной структурой диссоциируют на субъединицы и разворачиваются. «-» заряд, сообщаемы ДСН, пропорционален длине полипепт. цепи = массе)

• изоэлектрофокусирование – проведение ЭФ в градиенте рН, создаваемом при помощи Б-амфолинов (амфолины с разными значениями рН помещают в электрич поле, где они на носителе занимают точку, соответствующую pI амфолина. Б в разделяемой смеси займет то рН, кот соответствует pI)

• денситометрия – определение оптической плотности Б в необработанном ПААГ для количественной оценки результатов (фотометрия через колонку геля)

Применение:

• медицинское исследование содержания Б в био. жидкостях

• протеомика

• разделение низкомолекулярных веществ (АК и их производные)

• исследование белкового и липидного спектра сыворотки крови пациентов

• определения альфа-фетопротеина в амниотической жидкости (электроиммунодиффузия с АГ)