Методы индикации и идентификации вирусов

Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:

1. Микроскопический: обнаружение вирусных включений в препаратах, окрашенных но Муромцеву, Морозову, Романовскому, Пигаревскому, Павловскому, обработанные флюорохромами.

2. Вирусологическое выделение вирусов в культурах клеток, в развивающихся куриных эмбрионах, на лабораторных животных (состояние, симптомы).

3. В культуре тканей: реакция гемаглютинации (РГА), реакция гемадсорбции (РГадс), цитопатогенное действие (ЦПД), цветная проба, метод бляшек.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:

• реакция торможения гемагглютинации (РТГА),

• реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),

• реакция связывания комплемента (РСК),

• реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),

• реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),

• реакция преципитации в геле (РП),

• реакция нейтрализации цветной пробы.

Приложение 4

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций.Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.

Заражение невскрытого эмбриона

А) В хорион аллантоисную полость: Делают по границе воздушной камеры яйца под углом 45° к его поверхности на глубине 0,3-0,5 см. После введения вирусного материала отверстие заливают расплавленным парафином, и эмбрион в специальных лотках помещают в термостат-инкубатор приt° +40; +42С° и влажности в 60 %.

Б) В амнион и куриный зародыш:Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговыхпункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.

После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.

Заражение вскрытого эмбриона:

Выполняют после снятия изогнутыми ножницами крышки яйца над его воздушной камерой, которую снимают очень осторожно.

А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.

Б) Заражение в желточный мешок проводят также.

В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для приданиягерметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.

Контрольные наблюдения ведут по критериям:

• подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;

• появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;

• общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 3).

Приложение 5

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ С РАЗНЫМ ГЕНОМОМ

1.

ДНК- геномные цитоплазматические (вирус натуральной оспы)

Адсорбция на клетке- виропексис

Депротеинизация, освобождение генома

Стратегия вирусного генома (СВГ)

Репродукция ДНК

Все этапы в цитоплазме клетки

Репродукция ДНК (с участием эндорепликазы)

Трансляция на рибосомы

Сборка вириона

Выход из клетки

Синтез вирусного белка

Эндогенная (вирусная) транскриптаза

Транскрипция

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки-хозяина

И-РНК

2.

ДНК -геномные ядерные (вирус герпеса)

Адсорбция на клетки -виропексис

Депротеинизация. Освобождение генома

СВГ

Редупликация ДНК в ядре клетки хозяина

Разобщенный (дизъюнктивный) синтез

Репродукция ДНК в ядре клетки с участием экзорепликаз

Сборка вириона в цитоплазме

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки

Экзогенная транскрипция (клеточная)

И-РНК транскрипция

Трансляция на рибосомы

Итак, синтез идёт по схеме: ДНК РНК белок

3.

РНК-геномные минуснитевые (вирус гриппа)

Адсорбция на клетке- виропексис

Депротеинизация. Освобождение генома

СВГ

Редупликация ДНК

И-РНК

Экзогенная транскриптаза

транскрипция

М-РНК

М-РНК + репликативная форма

- Р «отштамовка» нитей с матрицы

Синтез вирусного белка на рибосоме

-РНК

-РНК

+РНК

Сборка вириона

+РНК выполняет функции И- РНК

Трансляция на рибосомы

Синтез вирусного белка

Итак, синтез идет по схеме РНК РНК белок

4.

РНК геномные + нитевые

Адсорбция

Депротеинизация

СВГ

РНК

Функции И-РНК выполняет +РНК нить

Вирусный белок

+РНК

Экзотранскриптаза

+РНК

Трансляция на рибосомы

Синтез вирусной репликазы (эндорепликазы)

+РНК

-РНК

Матрица для образования +нитей ДНК

Сборка вириона

Синтез вирусного белка

Репликативная форма

Итак, синтез идет по схеме: РНК белок

5.

ДНК онкогенные вирусы

Адсорбция

депротеинизация

Интеграция в геном ДНК клетки хозяина

Редупликация ДНК

Сборка вириона

И-РНК

Белок вирусный

Итак, синтез идет по схеме: ДНК РНК белок

6.

РНК онкогенные вирусы (обратная транскрипция)

Адсорбция- виропексис

Депротенизация

РНК (одна нить)

В вирионе формируется РНК зависимая ДНК полимераза

Синтез двунитчатой ДНК (провирус)

СВГ

Редупликация ДНК

Сборка вириона созревание на мембранах клетки

Трансляция ДНК (провируса при участии РНК- полимеразы клетки)

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки