5 Лекция по БТ НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

• Непрерывное культивирование позволяет получить высокую производительность процесса и стабильные характеристики продукта.

• Существуют два вида непрерывных процессов ферментации – тубулярные и хемостатные.

• ТУБУЛЯРНЫЕ процессы реализуются в аппаратах полного вытеснения, а ХЕМОСТАТНЫЕ – в аппаратах полного смешения.

ТУБУЛЯРНЫЙ ПРОЦЕСС

S₀, F

X₀

L

F, S, X

λ

F – расход жидкости через аппарат ;

S, S₀ – концентрация субстрата на выходе и на входе в аппарат;

X, X₀ - концентрация биомассы на выходе и на входе в аппарат;

L -полная длина или высота аппарата ;

λ -расстояние от входа в аппарат до произвольно взятого сечения;

А – площадь сечения

ТУБУЛЯРНЫЙ ПРОЦЕСС

• Питательная среда и посевной материал непрерывно поступают в аппарат, в котором нет обратного смешения. На входе в аппарат жидкость смешивается с посевным материалом. По мере продвижения в аппарате одновременно осуществляются рост биомассы и биосинтез продукта.

• Время пребывания жидкости в аппарате t_L = LA / F.

• Время пребывания жидкости от входа в аппарат до произвольно взятого сечения t _λ = λ A /F

• С учётом связи времени пребывания и длины аппарата кривые изменения всех концентраций такие же, как в периодическом процессе.

РЕЦИРКУЛЯЦИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В ТУБУЛЯРНОМ АППАРАТЕ

(F₀ – F), S₀

F, X , S

F₀ , X

• Необходимость непрерывной подпитки посевного материала можно исключить путём организации рециркуляции части потока с выхода аппарата на вход.

• Преимуществом тубулярного процесса является возможность более полного исчерпания субстрата.

• Недостатки – невозможность организовать аэрацию во всех зонах по длине аппарата, большая склонность к инфицированию посторонней микрофлорой.

ХЕМОСТАТНЫЙ ПРОЦЕСС НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

F, S₀

• Процесс ферментации протекает в аппарате с перемешиванием. В аппарат с постоянной скоростью F подводится свежая питательная среда.

• Из аппарата с той же скоростью отводится ферментационная среда, содержащая биомассу X, продукт метаболизма P, и остаточный субстрат S.

• Посевной материал в аппарат подаётся только в момент запуска. Объём жидкости в аппарате V сохраняется постоянным.

F,S,X,P

P,S,X

V

ПРОСТЕЙШАЯ МОДЕЛЬ ПРОЦЕССА

• Принимаем, что процесс направлен только на рост биомассы, поэтому нет специального уравнения для биосинтеза целевого продукта dP/dt.

• Принимаем субстрат-зависимую модель роста (Моно), так что ингибирующего продукта нет и уравнения для него не нужно.

• Принимаем, что в процессе роста отсутствует диссимиляция биомассы ( )

• Принимаем, что для лимитирующего субстрата нет затрат на поддержание жизнедеятельности культуры (m_S = 0)

СИСТЕМА УРАВНЕНИЙ

• Материальный баланс процесса:

• V(dX/dt) =[μ_mS/(K_S + S)]XV - FX

• V(dS/dt)= FS₀–FS –(1/Y_XS) [μ_mS/(K_S+S)]XV

• Принимаем обозначение D = F/V, где D – скорость разбавления, [1/час]

• Упрощённая запись системы уравнений:

• dX/dt = μX –DX

• dS/dt =D(S₀ –S) – (1/Y_XS) μX

УСЛОВИЯ СТАЦИОНАРНОСТИ

• В отличие от периодического процесса в непрерывном хемостатном процессе довольно быстро устанавливается стационарное состояние, при котором скорость роста биомассы будет равна скорости её вымывания из аппарата, а скорость притока субстрата за вычетом оттока остаточного субстрата равна скорости его расходования на рост биомассы микроорганизмов.

• При этом (dX/dt) = 0 и (dS/dt) = 0

ПАРАМЕТРЫ СТАЦИОНАРНОГО ПРОЦЕССА: СКОРОСТЬ РОСТА

• Из условий стационарности получаем:

• μX – DX = 0 , откуда μ = D

• Таким образом, в установившемся состоянии удельная скорость роста биомассы становится равной скорости разбавления D. Это очень удобно, поскольку скорость разбавления – это управляемый параметр, его задаёт оператор.

• Если в какой-то момент времени это равенство нарушится (μ ≠ D), то скорость роста биомассы .

• dX/dt =(μ – D)X будет либо положительной (и тогда биомасса увеличивается), либо отрицательной (соответственно, концентрация биомассы уменьшается). При этом устанавливается равновесие при той же скорости разбавления, но другой концентрации биомассы.

СТАЦИОНАРНЫЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА И БИОМАССЫ

• μ = D, или, с учётом выражения для μ:

• μ_mS/(K_S + S) = D, откуда получаем :

• S = K_SD/ (μ_m – D)

• D(S₀ –S) – (1/Y_XS) μX = 0, откуда :

• X = Y_XS {S₀ - K_SD/ (μ_m – D)}

• Графически выраженные зависимости X(D), S(D) называют «хемостатными кривыми»

X,S

D

0

X

S

D_кр

X₀

«ВЫМЫВАНИЕ» КУЛЬТУРЫ

• Хемостатная кривая X(D) показывает, что при повышении скорости разбавления концентрация биомассы снижается до нуля при некоторой критической скорости разбавления D_кр и при более высоких скоростях разбавления остаётся равной нулю.

• Физически это означает, что культура «вымывается»: выходит больше биомассы, чем может вырасти. Ясно, что при этом концентрация субстрата в выходящем потоке такая же, как на входе в аппарат – S₀ .

КРИТИЧЕСКАЯ СКОРОСТЬ РАЗБАВЛЕНИЯ

• Приравнивая уравнение для концентрации биомассы нулю, получаем величину D= D_кр

• X = Y_XS {S₀ - K_SD/ (μ_m – D)} = 0

• откуда D_кр = μ_m S₀/(K_S + S₀)

• Физически это означает, что критическая скорость разбавления равна удельной скорости роста биомассы при концентрации субстрата, равной его концентрации в подаваемом потоке среды.

РЕПЕРНЫЕ ТОЧКИ КРИВОЙ X(D)

• Зависимость X(D) имеет 2 реперные точки:

• X = X₀ при D = 0 и D= D_кр при X = 0

• Обе эти точки (X₀ и D_кр ) зависят от S₀

• Вид зависимостей представлен на графике (линейная для X₀ и с насыщением для D_кр )

D_кр

X₀

S₀

0

ХЕМОСТАТНЫЕ КРИВЫЕ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ S₀

X

0

D

КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБСТРАТА В СВЕЖЕЙ СРЕДЕ

• Таким образом, и начальное положение хемостатной кривой, и точка вымывания зависят от концентрации субстрата в свежей среде (подпитке) S₀

• Эта величина наряду со скоростью разбавления является параметром, с помощью которого оператор может управлять процессом. Чем больше S₀ , тем выше концентрация биомассы в выходном потоке, причём в довольно широком диапазоне скоростей разбавления.

ОСТАТОЧНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБСТРАТА

• Интересную особенность имеет зависимость стационарной (остаточной) концентрации субстрата от начальной (входной) его концентрации. В полученной формуле нет ничего, кроме скорости разбавления и кинетических констант.

• Из этого следует парадоксальный вывод: при любом изменении концентрации субстрата во входящем потоке S₀ в стационарном состоянии при заданной скорости разбавления устанавливается одна и та же остаточная концентрация субстрата S. Именно это свойство хемостата дало ему название: концентрация субстрата (химического соединения) стабилизируется сама по себе независимо от колебаний на входе.

ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ ХЕМОСТАТА

• Производительность Q_X – количество биомассы, образующееся в единицу времени в единице объёма среды аппарата

• Q_X =DX подставляем выражение для X:

• Q_X =D Y_XS {S₀ - K_SD/ (μ_m – D)}

• Для определения D_опт приравниваем нулю частную производную Q_X по D,

• откуда: D_опт = μ_m { 1 - }

ОПТИМАЛЬНАЯ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ ХЕМОСТАТА

D

X

Q_x

0

D_опт

D_кр

D

СРАВНЕНИЕ НЕПРЕРЫВНОГО И ПЕРИОДИЧЕСКОГО ПРОЦЕССОВ

• Представляет интерес сравнить между собой в сопоставимых условиях два способа ферментации – периодический и непрерывный.

• При сравнении возьмём процесс с одинаковыми кинетическими константами – максимальной удельной скоростью роста μ_m и характеристикой аппарата – максимально достижимой концентрацией биомассы X_m

• Расчёты проведём в общем виде.

ПЕРИОДИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС

• Предполагается, что между двумя последовательными процессами роста микроорганизмов имеет место «пустой», непродуктивный период, связанный с подготовкой аппарата, загрузкой среды и посевного материала и с лаг-фазой процесса – общее время t₀ .

• После этого от исходной концентрации X₀ до максимально достижимой в данном аппарате X_m рост идёт до самого конца ферментации (время t_m) с максимальной удельной скоростью роста μ_m ._.

РОСТ В ПЕРИОДИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ ФЕРМЕНТАЦИИ

X

X_m

X₀

0

t₀

t_m

t

ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРИОДИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

• dX/dt = μ_mX (при t > t₀)

• Решение уравнения X = X₀ e^{(t- t0)μm} или ln X = lnX₀ + μ_m ( t - t₀)

• Концентрация X = X_m достигается в момент времени t = t_m , для которого

• ln X_m = ln X₀ + μ_m ( t_m - t₀) ,

откуда t_m = t₀ + (1/ μ_m ) ln (X_m/X₀)

• Q_X^период = X_m /t_m =X_m μ_m/[ ln (X_m/X₀) + μ_mt₀ ]

ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ НЕПРЕРЫВНОГО ПРОЦЕССА

• Анализируем формулу для D_опт. Поскольку K_S обычно значительно меньше S₀ , величина D_опт ≈ μ_m и производительность непрерывного процесса Q_X^непр ≈ X_m μ_m

• Соотношение производительностей RQ:

• RQ = Q_X^непр / Q_X^период ≈

• ≈X_m μ_m/ {X_m μ_m/[ ln (X_m/X₀) + μ_mt₀ ]} или RQ = ln (X_m/X₀) + μ_mt₀

ИСХОДНЫЕ ДАННЫЕ ДЛЯ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ

• В начале процесса инокулят обычно составляет по объёму около 5% от объёма среды, а концентрация биомассы в нём примерно такая же, как в конце ферментации.

• Обычное время подготовки аппарата (t₀) – около 10 часов.

• Величина μ_m для быстро растущих культур (бактерии, дрожжи) составляет 0,5 ч^-1, а для медленно растущих (грибы, актиномицеты) – 0,05

ЦИФРОВАЯ ОЦЕНКА ВЕЛИЧИНЫ RQ

• (X_m/X₀) = (100%)/(5%) = 20

• Ln (X_m/X₀) ≈ 3

• Упрощённая зависимость: RQ = 3 + 10 μ_m

• Таким образом, для быстро растущих культур соотношение RQ составляет ≈ 8, а для медленных ≈ 3,5

• Итак, непрерывный процесс для процессов роста эффективнее периодического.

АВТОСЕЛЕКЦИЯ

• В ходе процесса непрерывного культивирования в культуре происходят изменения, в результате которых может появиться штамм, имеющий более высокую удельную скорость роста, чем исходный.

• С этого момента оба штамма начинают конкурировать за субстрат.

• Проведём анализ этого процесса

μ

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАВИСИМОСТИ ИСХОДНОГО И МУТАНТНОГО ШТАММОВ

μ₂

D₂

μ₁

D₁

S

0

S₂

S₁

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ В ПРОЦЕССЕ АВТОСЕЛЕКЦИИ

• На графике изображены кинетические зависимости μ₁(S) для исходного и μ₂(S) для вновь образовавшегося мутантного штамма.

• Если процесс протекает при скорости разбавления D₁ , то исходный штамм обеспечивает саморегулирование процесса при концентрации субстрата в среде S₁ .

КАК СЕБЯ ЧУВСТВУЕТ ШТАММ-МУТАНТ?

• Для штамма-мутанта концентрация субстрата S₁ обеспечивает удельную скорость роста μ₂(S₁) =D₂, которая значительно больше скорости разбавления D₁

• Следовательно, концентрация биомассы мутантного штамма растёт:

• dX₂/dt = {μ₂(S₁) - D₁}X > 0

• Рост продолжается до тех пор, пока концентрация субстрата не снизится до S₂.

КАК СЕБЯ ЧУВСТВУЕТ ИСХОДНЫЙ ШТАММ?

• При уменьшении концентрации субстрата концентрация биомассы исходного штамма начинает уменьшаться :

• dX₁/dt = {μ₁(S₂) - D₁}X < 0

• Следствием этого становится вымывание исходного штамма и замена его мутантным.

• Концентрация биомассы при этом возрастает по сравнению с той, которая была при исходном штамме

ВНЕШНИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ПРОЦЕССА АВТОСЕЛЕКЦИИ

• Если наблюдать за концентрацией биомассы в процессе непрерывного культивирования, можно заметить скачкообразные повышения концентрации, свидетельствующие о самопроизвольной селекции (автоселекции).

X

0

t

ЗНАЧЕНИЕ АВТОСЕЛЕКЦИИ

• Итак, длительный непрерывный процесс может быть использован для отбора штаммов, обеспечивающих более высокую скорость роста биомассы микроорганизмов.

• Улучшение штаммов по удельной скорости роста не всегда полезно. При этом иногда происходит ухудшение качества белка и других компонентов клетки и снижение её способности к биосинтезу полезных метаболитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ В ХЕМОСТАТЕ

• В хемостате удобно определять кинетические константы. Задавая скорость разбавления, мы сразу имеем удельную скорость роста, которую в периодическом процессе можно получить лишь на основании двух-трёх измерений X на интервале времени Δt.

• Концентрация субстрата S в хемостате требует только одного измерения, а в периодическом процессе – минимум двух для определения среднего значения за интервал времени.

• Все эти измерения требуется проводить при 4 – 5 парах значений μ и S, так что преимущество непрерывного процесса очевидно.

ПРЕИМУЩЕСТВА НЕПРЕРЫВНОГО СПОСОБА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

• Рост биомассы можно поддерживать неопределённо долго.

• Можно поддерживать постоянную концентрацию биомассы.

• Можно длительно поддерживать рост, лимитированный одним заданным субстратом.

• Удобно определять кинетические константы.

• Более высокая производительность по сравнению с периодическим.

• Результаты, полученные в непрерывном процессе, более надёжны и воспроизводимы, чем в периодических.

• Облегчены механизация и автоматизация.

• Постоянное качество готового продукта.

• Меньше контакт персонала с микроорганизмами.

• Возможна автоселекция микроорганизмов.

• Меньше износ измерительных приборов.

НЕДОСТАТКИ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

• Меньшая гибкость, регулировать можно только некоторые параметры.

• Более высокие требования к постоянству качества сырья.

• Больше капитальные вложения.

• Трудно непрерывно дозировать нерастворимые твёрдые субстраты.

• Больше опасность инфицирования из-за большей длительности культивирования.

• Возможность «вырождения» культуры за счёт автоселекции.

• Не всегда достигаются хорошие результаты для биосинтеза продуктов метаболизма.

• Трудно культивировать мицелиальные культуры из-за вязкости, гетерогенности и пристеночного роста.

• Повышенные требования к надёжности оборудования