Занятие № 5

ТЕМА. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ,

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Цель занятия: Ознакомиться с современными представлениями о механизме действия ферментов и кинетике ферментативных реакций.

Исходный уровень знаний:

- белковая природа ферментов;

- структура сложных ферментов;

- строение молекулы фермента;

- кинетика химических реакций.

Содержание занятия.

I.2. Современные представления о механизме действия ферментов (гипотеза Фишера, Кошланда).

Полифункциональный катализ.

Кинетика ферментативных реакций. Константа Михаэлиса.

Зависимость активности ферментов от различных факторов.

Определение активности ферментов: принцип, значение в медицине.

II.1. Работа № 1. Активность  - амилазы слюны.

Принцип метода.

Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством (в мл) 0,1% раствора крахмала, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при температуре 38⁰С в течение 30 минут. В норме амилазная активность равна 160 - 320. Амилазная активность обозначается А 38⁰/30'. Этот метод широко используется для определения амилазной активности крови и мочи.

Порядок выполнения работы:

В 10 пробирок налить по 1 мл воды. В 1-ю пробирку добавить 1 мл слюны, разведённой в 10 раз. Содержимое пробирки перемешать несколько раз, втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набрать в пипетку 1,0 мл смеси и перенести её во 2-ю пробирку. Содержимое тоже перемешать и 1,0 мл перенести в 3-ю пробирку и т. д. до 10 пробирки. Из 10-ой пробирки 1,0 мл смеси вылить.

1 мл слюны

1 мл смеси

1 мл воды

n

I II III

Рис. 3. Разведение слюны

Во все пробирки добавить по 1,0 мл воды и по 2,0 мл 0,1% раствора крахмала, встряхивая, перемешать и поместить в термостат при 38⁰С на 30 минут. После инкубации пробирки охладить водопроводной водой, добавить по 1 капле 0,1% раствора йода и перемешать. Отметить окраску в каждой пробирке и, пользуясь таблицей, сделать расчет.

Расчет:отметить пробирку, где гидролиз крахмала прошел полностью при наименьшем количестве фермента и по количеству неразведённой слюны (А) в данной пробирке рассчитать амилазную активность (Х) следующим образом:

А мл слюны расщепили 2,0 мл 0,1% раствора крахмала.

1 мл слюны расщепил Х мл раствора крахмала.

В 3-й пробирке, например, А =1/80 мл.

	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение слюны
Окраска р-ра с йодом

ВЫВОД:

Работа № 2. АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

(ДИАСТАЗЫ) МОЧИ

Принцип метода.

Метод основан на определении времени, необходимого для полного расщепления крахмала в присутствии 1 мл мочи. Условно за единицу активности амилазы мочи принимают количество фермента, расщепляющего 2 мг крахмала за 15 минут. Активность амилазы выражают количеством единиц в 1 мл мочи. В норме она составляет 1-2 ЕД, а по методу Вольгемута колеблется от 16 до 64 ЕД.

Моча здоровых людей обладает низкой амилазной активностью по сравнению с амилазой слюны. Определение активности -амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинике при диагностике заболеваний поджелудочной железы. В первые сутки заболевания амилазная активность увеличивается в моче и сыворотке крови в десятки раз, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита. Вирус гриппа также поражает поджелудочную железу, но реже.

Порядок выполнения работы.

На сухую чашку Петри капнуть в разных местах по 1 капле 0,1% раствора йода в йодиде калия (всего 8-10 капель). В пробирку внести 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержащего 2 мг крахмала, 1 мл 0,85% р-ра хлорида натрия и поместить пробирку в термостат при 37⁰С на 2 минуты. Через 2 минуты добавить в пробирку 0,5 мл мочи, перемешать и отметить время начала реакции. Затем каждые 2-3 минуты переносить каплю смеси из пробирки на чашку Петри в каплю раствора йода до появления желтой (или бесцветной) окраски и отметить время реакции в минутах. Активность амилазы мочи рассчитать по формуле:

15

Х =

Т ∙ 0,5

где Х - активность амилазы в 1 мл мочи;

15 - время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала в минутах;

0,5 - количество мочи, взятое в реакционную смесь в мл;

Т - время реакции в минутах.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Какую реакцию катализирует амилаза?

Укажите промежуточные и конечные продукты гидролиза

крахмала.

Чему равна в норме диастаза мочи?

При каких заболеваниях повышается активность диастазы

мочи (у взрослых и детей)?

Когда в моче отсутствует амилаза?

Напишите формулы витаминов В₂ и РР, укажите

соответствующие коферменты.

Материал для самоподготовки: Iа) 1. с.129-139, 143-152; II; III