Современные методы лабораторной диагностики.
В ходе вспышек БВВЭ и Геморрагический Лихорадки Марбург (ГЛМ) инфекции подтверждаются различными лабораторными диагностическими методами, такими как: изоляция вируса в клеточных культурах; полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), включающая количественную ОТ-ПЦР в режиме реального времени; энзим-связывающий иммуносорбентный анализ с захватом антител (ELISA) или, по-другому, иммуноферментный анализ (ИФА); обнаружение антигена методом иммунофлюоресценции и IgG-IgM-энзим-связывающий иммуносорбентный анализ с захватом антител с использованием аутентичных вирусных антигенов.
Гистологические методы, такие как выявление антигенов иммуногистохимическим анализом и другие чувствительные методы, используются в частности для посмертной диагностики.
Диагностика методом обнаружения вирусных антигенов подходит для пациентов в ранней стадии заболевания, в то время как серологическая диагностика по выявлению специфических IgM и IgG подходит для пациентов в относительно поздней стадии болезни.
Первый метод особенно применим для пациентов, которые умирают до того, как установится иммунный ответ со специфическими антителами. Диагностика вирусных геморрагических лихорадок, в том числе БВВЭ и ГЛМ, должна быть чувствительной, специфичной и надежной, поскольку ошибочная диагностика вирусных геморрагических лихорадок может привести к огромным волнениям в обществе. В действительности же, в районах вспышек БВВЭ и ГЛМ, пациенты с данными заболеваниями должны быть срочно изолированы. Это означает, что лица с ложно-положительными результатами подвергаются риску заражения за счет размещения в среде с высокой степенью опасности, такой как изолятор. Ложно-отрицательный результат же приведет к тому, что лица, являющиеся опасными источниками инфекционного заражения будут допущены к обществу с уверенностью, что у них нет геморрагической лихорадки, когда как на самом деле будут иметь потенциально высокую контагиозность и возможность выступать в качестве источника передачи инфекции от человека к человеку.
Таким образом, диагностика не должна полагаться на какой-либо один лабораторный метод. Риск постановки неправильного диагноза должен быть сведен к минимуму.
Остановимся подробнее на каждом из лабораторных диагностических методов.
Изоляция вируса является основным, простым и чувствительным методом диагностики БВВЭ и ГЛМ. EBOV и MARV хорошо растут в большом разнообразии клеточных линий, но обычно используются клетки Vero и Vero E6. Биологические образцы, такие как кровь, должны быть отправлены в лаборатории BSL-4, которыми располагают развитые страны и которые зачастую находятся на значительном отдалении от области вспышки заболевания. Пересылка образцов для диагностики вируса должна осуществляться в специальных условиях (в холодильном оборудовании на протяжении всего периода от отгрузки до прибытия), что часто трудноосуществимо. Таким образом, диагностические критерии, основанные на изоляции одиночного вируса, не несут этиологического значения.
Японскими учеными была создана панель моноклональных антител к рекомбинантному NP (РНП) эболавируса Заир, эболавируса Рестон и Марбург вируса озера Виктория. Были разработаны моноклональные антитела, специфичные только для NP эболавируса Заир, для NP эболавируса Рестон, для наночастиц эболавирусов Заира и Судана, для наночастиц эболавирусов Заира и Рестон, и для NP только Мурбург вируса озера Виктория. С помощью этих моноклональных антител, стало возможным серологическое выявление изолированных видов EBOV и MARV.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), включающая количественную ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Хорошо проявила себя в условиях эпидемии, особенно в очагах БВВЭ в Демократической Республике Конго в 1995 году, в Габоне в 1996 году, и в Уганде в 2000 г. Во время вспышки БВВЭ в Уганде в 2000 году была разработана гнездовая ОТ-ПЦР с использованием наборов праймеров, предназначенных специально для НП эболавируса штамма Судан области Гулу, который был причинным EBOV для начала эпидемии. Недавно так же были разработаны количественные ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Была доказана чувствительность, специфичность и эффективность данных методов молекулярной диагностики для идентификации филовирусных инфекций. Несмотря на это, должна быть исключена возможность ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов, так как чувствительность ОТ-ПЦР систем несколько отличается от лаборатории к лаборатории.
Энзим-связывающий иммуносорбентный анализ с захватом антител (ELISA) или иммуноферментный анализ (ИФА). Когда инфекция БВВЭ или ГЛМ становится фатальной, пациенты, как правило, умирают до развития антительного ответа. Этот факт свидетельствует о том, что серологические диагностика пригодна для диагностики инфекции у пациентов, которые выживают, но не у тех, кто поддается инфекции. Высокие титры инфекционных филовирусов присутствуют в крови и тканях пациентов на ранней стадии болезни, предполагая, что обнаружение антигенов вируса подходит для диагностики БВВЭ и ГЛМ на ранней стадии.
ИФА с захватом антигенов был разработан для обнаружения антигенов EBOV; он был использован в клинических условиях, таких как вспышки БВВЭ в Демократической Республике Конго в 1995 году, в Габоне в 1996 году, а в Уганде в 2000 году и была подтверждена его эффективность в диагностике. В ИФА с захватом антигенов был использован пул моноклональных антител к эболавирусу Заир, Судан и кроличья сыворотка. Были разработаны и другие ИФА с захватом антител, белками-мишенями в которых стали NP, VP40, и GP. Развитые методы ИФА для обнаружения антигенов филовирусов используют уникальные моноклональные антитела к r NP эболавируса Заир, эболавируса Рестон и Марбург вируса озера Виктория. Несмотря на то, что моноклональные антитела были получены путем иммунизации мышей рекомбинантными наночастицами, ИФА обнаруживает не только рекомбинантные наночастицы этих вирусов, но и подлинный эболавирус Судан, эболавирус Рестон, а также отдельно эболавирус Рестон, и отдельно Марбург вирус. Считается, что ИФА подходит для быстрой и точной диагностики БВВЭ и ГЛМ, эффективность этих способов ИФА должна быть оценена при помощи сравнения образцов лечения пациентов в клинических условиях и в реальных случаях вспышек БВВЭ и ГЛМ.
Диагностика антител к возбудителям БВВЭ и ГЛМ методом непрямой иммунофлюоресценции с подлинными вирусными антигенами, изготовленными из клеток, инфицированных вирусом, широко использовалась, проявляя высокую чувствительность для обнаружения антител в начале выздоровления, используется в сероэпидемиологических обследований распространенности антител и является эффективным не только в диагностике, но и в полевых исследованиях EBOV инфекций.
Однако применение этого метода не представляется возможным для институтов без BSL-4 лабораторий для подготовки подлинных антигенов филовирусов. Учитывая рост вспышек БВВЭ, увеличение миграции людей и возможность биотерроризма, диагностические системы для вирусных геморрагических лихорадок необходимы даже в тех странах, где BSL-4 лаборатории не доступны. Для того, чтобы преодолеть эту трудность, были разработаны рекомбинантные диагностические системы на основе белка для вирусных геморрагических лихорадок.