Занятие 2 Физико-химические свойства белков

Цель занятия: познакомить студентов с методами разделения и очистки белков

Вопросы для подготовки к занятию

1. Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация.

2. Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрического заряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда. Понятие изоэлектрической точки белков.

3. Обратимое осаждение белков – высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс.

4. Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны – класс белков, защищающий другие белки от денатурации в условиях клетки и облегчающие формирование их нативной структуры.

5. Методы выделения индивидуальных белков: гель-фильтрация, ионообменная, афинная хроматография.

6. Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация). Применение.

Практическая часть занятия Высаливание белков сыворотки

Принцип метода: Высаливание белков сыворотки крови (NH₄)₂SО₄ может быть использовано для разделения альбуминов от глобулинов в связи с тем, что глобулины осаждаются при 50% насыщении, а альбумины при 100% насыщении (NH₄) ₂SО_4.

Ход работы. Налить в пробирку 2-3 мл сыворотки крови и добавить равный объем насыщенного раствора (NH₄) ₂SО₄. Через 15 минут осадок отфильтровать и к фильтрату добавить сухого (NH₄) ₂SО₄ до полного насыщения. Осадок через 10 минут отфильтровать. Для доказательства обратимости высаливания полученные осадки прямо на фильтрах смочить 2-3 мл дистиллированной воды. Отметить растворение их. С фильтратами проделать биуретовую пробу.

Результат:

Вывод:

Тепловая денатурация белков

Принцип метода. При нагревании глобулярных белков происходит их тепловая денатурация. При этом белки выпадают в осадок

Ход работы. Налить в пробирку 2-3 мл раствора белка, добавить 2-3 капли 5% расвора уксусной кислоты и нагреть до кипения.

Результат:

Вывод:

Осаждение белков органическими растворителями

Принцип метода. При длительном воздействии некоторых органических растворителей (спирт, ацетон и др.) на глобулярные белки происходит их десальватация и денатурация.

Ход работы. К 0,5 мл раствора белка осторожно по стенке прилить 1-2 мл спирта. Отметить появление белого кольца на границе наслаивания.

Результат:

Вывод:

Осаждение белков органическими кислотами

Принцип метода. Ряд органических кислот вызывает денатурацию белков. Наиболее широко в различных биохимических исследованиях для осаждение белков применяются трихлоруксусная (ТХУ) и сульфосалициловая кислоты (ССК). В медицине применяют для обнаружения белка в моче.

Ход работы. Налить в пробирку 1-2 мл раствора белка и добавить равный объем 5% ТХУ.

Результат:

Вывод:

Ход работы. К 0,5 -1 мл раствора белка добавить 5-6 капель 20 % ССК

Результат:

Вывод:

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Многие концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка. Осаждение белков азотной кислотой лежит в основе пробы Геллера, широко используемой в практике обнаружения белка в моче.

Ход работы. К 0,5 -1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наслоить равный объем раствора белка. На границе наслаивания отметить образование белого кольца.

Результат:

Вывод:

Домашнее задание

Решить ситуационные задачи и ответить на вопросы

1. С целью стерилизации различных объектов их обрабатывают формальдегидом. Что происходит при этом с белками?

2. Препараты, содержащие березовый деготь, обладают выраженным антимикробным действием. Предположите возможный механизм действия, исходя из того, что березовый деготь содержит в своем составе фенол.

3. Для профилактики инфекционных заболеваний контактным лицам вводят препарат из крови рековалесцентов, содержащих антитела к данному заболеванию. Этот препарат называется гамма-глобулин. Как его получить из сыворотки крови? Как очистить от примесей?

4. Вам дали две пробирки с осажденным белком. Известно, что один осадок получен при действии сернокислого аммония, а второй – после добавления ТХУ. Как отличить их? В чем сходство и в чем отличие при действии этих агентов на белок?

5. Имеются пробирки с растворами: I концентрированной азотной кислоты

II10% трихлоруксусной кислоты

III СuSO4 в10% NaOH

Опишите, какие процессы произойдут в каждой пробирке при добавлении в них раствора белка. Какие из этих реакций находят практическое применение?

Решить тестовые задания

1. Выберите правильный ответ.

Полярной незаряженной аминокислотой является:

1- изолейцин

2 - аспартат

3- глутамат

4- метионин

5- серин

2. Выберите правильные ответы.

Неполярные аминокислоты

1- изолейцин

2 - аспартат

3 - глутамат

4 - метионин

5- серин

6- триптофан

3. Выберите правильные ответы.

Аминокислота, располагающаяся преимущественно внутри белковой глобулы:

1- глицин

2 – аспарагиновая кислота

3 – лейцин

4 – аргинин

5 – серин

4. Выберите правильный ответ.

Аминокислота, способная образовывать ионую связь с лизином

1 - глицин

2 – аспарагиновая кислота

3 – лейцин

4 – аргинин

5 – серин