Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге

Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д.

Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол СН₃СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге, увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов.

Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя.

Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина.

Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (Б) А

Rf.= ----

Б

Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта.

Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашм, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот.

На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего краяс ратворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55°С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты.

Результат.

Вывод.

Домашнее задание:

1. Повторить классификацию и строение аминокислот (знать формулы)

2. Повторить типы связей в молекулах белка, стабилизирующих первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры.

3. Знать образование ди-, три- и полипептидов и их название.

4. Повторить методы изучения аминокислотного состава белков с помощью цветных реакций и хроматографии.

Литература:

1. Лекции по курсу биологической химии

2. Северин Е.С. Биохимия . М. 2003

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. 2001

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 1998

5. Строев Е.А.Биологическая химия. 1986

6. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В.. Биохимия. М. 2000

7. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001

СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Страйер Л. Биохимия М. Мир. 1984

2. Уайт А., Хенглер Ф. Смит Э. и др. Основы биохимии, М. 1981

3. Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 1993