КНОРРЕ_3227

Вторая группа ферментов, у которых катализ осуществляется без участия специальных кофакторов самой полипептидной цепью, - это нуклеофильные катализаторы. При этом типе катализа в ходе реакции происходит образо­ вание промежуточного соединения (интермедиата), в котором некоторый фрагмент субстрата ковалентно связывается с определенным аминокислот­ ным остатком белка.

Классическим примером ферментов, функционирование которых проис­ ходит по механизму нуклеофильного катализа, являются так называемые сериновые протеазы. Главными компонентами активного центра этих фермен­ тов выступают остаток серина, остаток аспартата и находящийся между ними остаток гистидина. Имидазольное кольцо последнего частично или полно­ стью оттягивает протон ОН-группы серина, в результате чего существенно повышается его нуклеофильность, что способствует атаке по СО-группе расщепляемой пептидной связи. В результате ацильный остаток N-концевого фрагмента расщепляемого субстрата (белка или пептида) атакуется нуклео­ фильным атомом О с разрывом пептидной связи и образованием ацилфермента и свободного С-концевого фрагмента. На второй стадии действия сериновых протеаз ацилфермент гидролизуется с освобождением N-концевого фрагмента гидролизуемого белка или пептида. Схему процесса можно запи­ сать в виде

Rr CO-NH-R2 + НО-Е -► R^CO-O-E + NH2-R2

R1-CO-O-E + Н20 -* RrCOOH + НО-Е,

где НО-Е - сериновая протеаза, НО - гидроксигруппа остатка серина, входя­ щего в активный центр фермента.

Специфические взаимодействия атакующего ацильного остатка с други­ ми компонентами активного центра определяют селективность протеазы. Основным участком, определяющим ее специфичность, является специаль­ ный карман, фиксирующий расщепляемую связь в определенном расположе­ нии относительно каталитической триады Asp-His-Ser. В случае трипсина на задней части этого кармана имеется отрицательно заряженный остаток ас­ партата, поэтому относительно каталитического центра фиксируются поло­ жительно заряженные боковые радикалы, и трипсин преимущественно рас­ щепляет пептидные связи, образованные СО-группой лизина и аргинина. Другой представитель сериновых протеаз - пищеварительный фермент химотрипсин. Он катализирует расщепление по остаткам гидрофобных амино­ кислот валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, тирозина и триптофана. У сериновой протеазы эластазы карман частично закрыт остатком валина, поэтому фермент преимущественно катализирует расщепление пептидных связей, образованных такими аминокислотами, как глицин и аланин.

К нуклеофильным катализаторам относится группа ферментов, интерме­ диатами которых являются продукты присоединения переносимого нуклео­ тидного остатка к атомам N боковых радикалов лизина и гистидина. Приме­ ром такого фермента является ДНК-лигаза - один из главных ферментов процесса репликации ДНК. Этот фермент, как уже описано в § 1.5, катализи­ рует соединение фрагментов Оказаки, образующихся при синтезе дочерней ДНК на запаздывающей нити. Суммарный процесс может быть записан уравнением

(pN)m-OH + pN(pN)n -> (pN)(m+n+i)

Первый из соединяемых фрагментов можно рассматривать как акцептор, а второй - как донор нуклеотидильного остатка. Непосредственная реакция фосфата донора с ОН-группой акцептора с образованием новой фосфодиэфирной связи термодинамически неблагоприятна. Для того, чтобы она мог­ ла пройти, необходимо активировать фосфат. В случае ДНК-лигаз это дости­ гается превращением фосфата в ангидрид с остатком рА. Донором такого остатка в случае фермента из эукариот и вирусов является АТР, который при этом превращается в ADP. У бактерий донором является NAD+ (§ 16.3). Было показано, что образование ковалентного фермент-субстратного интермедиата ингибируется пиридоксальфосфатом, альдегидная группа которого может взаимодействовать с s-аминогруппой остатка лизина. Данный факт свиде­ тельствовал об участии остатка лизина в реакции аденилирования. Сайтнаправленный мутагенез человеческого фермента показал, что при замене Lys568 в активном центре на His или Arg фермент становится неактивным и теряет способность аденилироваться, что свидетельствует о роли этого ос­ татка лизина как сайта аденилирования.

§ 16.3. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции

Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы, относятся к классу оксидоредуктаз. Большинство реакций, катализируемых оксидоредуктазами, обратимы. Поэтому, для того чтобы дать название фер­ менту, приходится выбирать определенное направление, с тем чтобы рас­ сматривать один из компонентов как окислитель, а второй - как восстанови­ тель. Оксидоредуктазы катализируют многочисленные и весьма разнообраз­ ные по типу реакции.

Окислителями спиртов и альдегидов являются в подавляющем большин­ стве случаев никотинамидные коферменты - никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) и его производное с фосфорилированной 2’-ОН-группой аденилового фрагмента - никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (NADP+).

§16.3. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции 355

составляет -0,33 В, что соответствует увеличению свободной энергии на 31,8 кДж/моль (1 В = -96,5 кДж/моль). Поэтому окисленная форма никотинамидного кофермента не может окислять -СН2-СН2-группы. Это же отно­ сится и к аналогичной стадии окисления жирных кислот. Непосредственным окислителем в реакции дегидрирования фрагмента -СН2-СН2- является изоаллоксазиновый остаток флавинового кофактора. Ниже приводится структу­ ра двух основных флавиновых кофакторов в окисленной и восстановленной формах.

флавинаденидинуклеотид (FAD)

окисленные формы

иR = Р-Ado FADH2

восстановленные формы

Для флавиновых кофакторов значения £° существенно выше, чем для никотинамидных коферментов, но все же являются отрицательным (-0,12 В для свободного кофактора). Поэтому FMN может непосредственно окислять NADH, но для дегидрирования фрагмента -СН2-СН2- его окислительного по­ тенциала недостаточно. В связи с этим в обеих системах дегидрирование -СН2-СН2-фрагментов осуществляет кофермент Q (гл. 18). Ферменты, катали­ зирующие дегидрирование, являются флавопротеидами, флавиновые кофак­ торы которых осуществляют промежуточный перенос электронов в реакции

356 Глава 16. Химия ферментов

-СН2-СН2- + CoQ -> -СН=СН- + CoQH2

Следует отметить, что применение термина «нуклеотид» к флавиновым кофакторам не вполне корректно, поскольку эти соединения не содержат в функциональной части гетероциклов, характерных для нуклеотидов. Кроме того, во флавиновых нуклеотидах вместо рибозы присутствует фрагмент пя­ тиатомного спирта рибита. Более правильными названиями являлись бы флавинмонофосфат и флавинадениндифосфат. Аналогично не совсем правильно называть никотинамидные коферменты динуклеотидами. Однако эта терми­ нология в биохимии прочно прижилась, и вводить в настоящем учебном по­ собии новую, более точную с точки зрения органической химии, терминоло­ гию нецелесообразно.

В отдельных случаях флавиновые кофакторы бывают ковалентно связан­ ными с апоферментом. Однако в большом числе случаев функционируют ферменты, представляющие собой комплексы с апоферментом, в котором компоненты связаны нековалентными взаимодействиями.

Характерным свойством флавиновых нуклеотидов является их способ­ ность к одноэлектронному окислению или восстановлению с образованием семихинонных радикалов из 7,8-диметил-изоаллоксазина. Возможны две структуры таких радикалов, содержащих неспаренный электрон на атомах 5N или 'N. Структуры всех радикальных форм кофакторов хорошо изучены на модельных системах, в основном на 1-апкил-изоаллоксазинах. Благодаря ха­ рактерным окраскам окисленной, восстановленной и свободнорадикальных форм этих соединений они достаточно легко выявляются в ферментах и полиферментных системах. Так, радикал с неспаренным электроном на атоме ’N имеет синюю окраску (А™-* « 580 нм), тогда как радикал с неспаренным электроном на атоме 5N - красную окраску » 470 нм). На схеме (см. ни­ же) изображены структуры этих радикалов. Прямоугольником выделен фраг­ мент 7,8-диметил-изоаллоксазина, подвергающийся изменению в процессе окисления-восстановления флавиновых кофакторов; буквой R обозначена остальная часть молекулы.

Вторая большая группа оксидоредуктаз - оксигеназы, катализирующие реакции, в которых окислителем является Ог. Эти ферменты разделяются на три основные подгруппы: оксидазы, монооксигеназы и диоксигеназы. К оксидазам относят ферменты, которые катализируют окисление субстратов, сопровождающееся переносом двух атомов Н на Ог с образованием Н20 2. Монооксигеназы катализируют реакции, в которых один из атомов кислорода молекулы Ог включается в субстрат, а второй входит в состав образующейся молекулы воды. Диоксигеназы катализируют включение в молекулу субстра­ та обоих атомов кислорода (при этом исходная молекула может распадаться на две). Все три перечисленные группы ферментов содержат один или не­ сколько кофакторов, являющихся непосредственными участниками окисли-

§ 16.3. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции 357

-[Н]

н+[Н]

"Синий" радикал

-[Н]

+[Н]

Окисленная форма

тельно-восстановительного процесса. В настоящее время известно более сот­ ни оксигеназ, которые являются флавопротеидами, в ряде случаев металлофлавопротеидами.

В качестве примера фермента оксидазы можно привести широко исполь­ зуемую для анализа глюкозы глюкозооксидазу, катализирующую реакцию:

В этом случае анализируется образующийся пероксид водорода.

Вторая чрезвычайно важная подгруппа оксидоредуктаз - монооксигеназы, которые катализируют окисление различных субстратов молекулярным кислородом в присутствии доноров электронов, таких как NADH, NADPH, восстановленных флавинов и др., выступающих в качестве кофакторов. При этом один атом О молекулы кислорода внедряется в субстрат, а другой вхо­ дит в состав образующейся молекулы воды.

Монооксигеназы в большинстве случаев являются гемопротеидами, т. е. содержат в качестве кофакторов молекулу гема. Гем - широко распростра­ ненный в живой природе кофактор. Он представляет собой комплекс ионов железа (II) или (Ш) с порфирином, соответственно ферроили ферригем. В § 6.2 приведена структура свободного гема, который является кофактором гемоглобина и миоглобина. В ковалентно связанном с белком виде он входит в состав цитохрома с, подвижного переносчика электронов на последнем этапе в цепи переноса электронов на Ог при окислительном фосфорилировании. Ковалентная связь образуется между винильными группам гема и двумя остатками цистеина белка

о = с

I СН—NH

Монооксигеназы очень важны для поддержания жизнедеятельности жи­ вых организмов. Это связано с тем, что все живые организмы, являясь откры­ тыми системами, поглощают из окружающей среды разнообразные химиче­ ские вещества (пищу, воду, воздух и все, что в них содержится). Среди этих веществ находятся и такие, которые не представляют питательной ценности и не могут быть использованы данным организмом. Если это слабораствори­ мые в воде липофильные органические соединения, то они с трудом выво­ дятся из клетки и могут накапливаться, вызывая токсические эффекты. За такими веществами в настоящее время закрепилось название ксенобиотики (от греч. xevcoG - чуждый). Практически во всех организмах, начиная от бак­ терий и кончая человеком, существуют ферментативные системы детоксика-

§ 16.3. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции 359

ции подобных веществ. Результатом действия таких систем является превра­ щение липофильных веществ в гидрофильные, которые выводятся из орга­ низма. Аналогичные ферментные системы принимают участие и в метабо­ лизме эндогенных липидных веществ: стероидов, простагландинов и др. Ключевыми ферментами этих систем являются гемопротеиды цитохромы Р450. Примером реакции, катализируемой цитохромом Р450, является гидроксилирование бензо[а]пирена:

Образующийся из 9,10-эпоксибензо[а]пирена под действием эпоксигидролазы его метаболит 7,8-дигидрокси-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидробензо[а]пирен яв­ ляется канцерогенным веществом:

Цитохромы Р450 представляют собой суперсемейство более чем 500 гемсодержащих ферментов с молекулярной массой 50-60 кДа, играющих важ­ ную роль в окислительных превращениях ксенобиотиков и на некоторых стадиях метаболизма. На сегодняшний день уже известно более 200 тысяч субстратов этих ферментов, присутствующих в клетках всех живых организ­ мов от бактерий до млекопитающих, включая человека.

Характерным свойством железопорфиринов является интенсивная полоса в электронном спектре в области 400 нм - полоса Соре. У цитохромов, со­ держащих нековалентно связанный гем типа 6, максимум в спектре погло­ щения комплекса с молекулой СО находится на 420 нм. Комплекс цитохрома Р450 с молекулой СО имеет аномальное положение полосы Соре на 450 нм, откуда и происходит название этого цитохрома. Причина спектральных особен­ ностей Р450, по-видимому, связана со спецификой аксиальных лигандов железа.

Железопорфириновые комплексы в первом приближении имеют октаэд­ рическую конфигурацию. Порфириновое кольцо имеет плоское строение.