ЗАНЯТИЕ №6
«ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ (ПРОДОЛЖЕНИЕ). МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АНАЭРОБОВ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ОБЛИГАТНЫХ ПАРАЗИТОВ (ХЛАМИДИЙ, РИККЕТСИИ, ВИРУСОВ)»
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
изучить методы выделения чистых культур анаэробов.
изучить основные биологические свойства риккетсии, хламидий, вирусов.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:
Виды энергетического метаболизма.
Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение).
Типы дыхания бактерий.
Морфологические особенности хламидий, риккетсии, вирусов.
Химический состав вирионов.
Строение бактериофагов.
Механизмы взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой.
Практическое использование бактериофагов.
Типы взаимодействия вируса с клеткой, стадии репродукции вируса.
Методы культивирования хламидий, риккетсии, вирусов.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
идентифицировать микроорганизмы.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ
о методах культивирования анаэробов
изучить основные биологические свойства риккетсии, хламидий, вирусов
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТА:
Культуральные свойства микроорганизмов_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Характеристика роста микроорганизмов на плотных питательных средах______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Характеристика роста микроорганизмов на жидких питательных средах______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Работа № 1. Методы выделения и идентификации анаэробных бактерий
Цель: изучить основные методы выделения и идентификации анаэробов
I
II
III
IV
А)
V
Г)
Б)
В)
I Сбор исследуемого материала
II Накопление культуры
III Получения изолированных колоний на плотных питательных средах
IV Накопление чистой культуры на тиогликолевой среде
V Идентификация выделенной чистой культуры
А) изучение морфологических и тинкториальных свойств
Б) изучение культуральных свойств
В) изучение биохимических свойств возбудителя по результатам посева на среды Гисса
Г) Реакция нейтрализации токсина на лабораторных животных, реакция флоккуляции
Вывод: анаэробы получают энергию, при отсутствии О2 путем ускоренного, но не полного расщепления питательных веществ. Для культивирования используют эксикатор, посев в толщу агара, среду Вильсон-Блера
Работа №2. Методы создания анаэробных условий
Цель: изучить методы создания анаэробных условий.
|
метод |
рисунок |
результат |
|
1) Вейнберга |
|
|
|
2) Анаэростат, эксикатор |
|
|
|
3) Тиогликолевая среда
|
|
|
|
4) метод Фортнера |
|
|
Вывод:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа №2. Биохимическая активность анаэробов.
Цель: изучить ферментативную активность микроорганизмов.
Самостоятельная работа: изучить сахаролитическую, протеолитическую и гемолитическую активность анаэробных бактерий. Зарисовать. Описать. Сделать вывод.
Среда Вильсон Блера
«К»
«О» 
Результат:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Молоко
«К» «О» «О»
Результат:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Среда
Цейсслера
Результат:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа 3. Культивирование внутриклеточных облигатных паразитов
Цель: разобрать основные принципы выделения и индикации хламидий, риккетсии и вирусов.
А). Самостоятельная работа. Используя таблицы, теоретическую справку изучить биологические модели культивирования вирусов, зарисовать, сделать вывод.
Культуры клеток
первичные полуперевиваемые неперевиваемые
Вывод:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Куриный эмбрион
Воздушное пространство
Отверстие в скорлупе
Скорлупная оболочка
Хорионаллантоисная оболочка
Желточный мешок
Белок
Амнион
Плод
Аллантоисная полость
Способы заражения:
1.___________________________________________________________________________
2.___________________________________________________________________________
3.___________________________________________________________________________
4.___________________________________________________________________________
5.___________________________________________________________________________
6.___________________________________________________________________________
Внимание! Заражение эмбриона происходит в асептических условиях, а вируссодержащий материал должен быть освобожден от бактерий путем добавления антибиотиков.
Вывод:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Лабораторное животное
Вывод:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Б). Самостоятельная работа. Используя таблицы, теоретическую справку изучить биологические модели культивирования хламидий, риккетсий. Сделать вывод.
Вывод:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА
к Работе №2
Методы создания анаэробных условий
1. Физические методы. Методы основаны на выращивании микроорганизмов в среде без воздуха.
Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества:
В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьино-кислый натрий.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующим веществами является среда тиогликолевая которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выращенной чистой культуры анаэробов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных питательных сред. Посев уколом.
Техника посева. Посев уколом в столбик агара (прямой агар) применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий и длительного хранения культур. При посеве уколом в пробирку с прямым агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают простерилизованной на пламени длинной совершенно прямой платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки. Вынимают иглу, обжигают край пробирки и пробки, закрывают пробирку, прожигают иглу, ставят ее в подставку, надписывают пробирку и помещают в штатив.
Посев по способу Веньяль-Вейона.
Техника посева. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50 С агаром засевают исследуемый материал. Затем помещают агар с посевом в стерильные трубки Веньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правша асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.
Механическое удаление воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы.
Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замена воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
2. Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия N838204.
3. Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со
строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1см. Получается 2 агаровых полу диска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заливают расплавленным парафином н помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 суток). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоен.