биодекструкция ксенобиотиков

 первой фазе происходят следующие реакции биотрансформации:  - окисление - гидроксилирование, декарбоксилирование, образование оксидов, десульфурирование, дегалогенизирование молекул, окисление спиртов и альдегидов;  - восстановление - восстановление альдегидов, азовосстановление, нитровосстановление;  - гидролиз - расщепление эфиров, амидных связей.  Основные энзимы, активирующие процессы биотрансформации первой фазы: цитохром Р-450 зависимые оксидазы смешанной функции (Р-450), флавинсодержащие монооксигеназы смешанной функции (ФМО), гидропероксидазы, алкоголь и альдегиддегидрогеназы, флавопротеинредуктазы, эпоксидгидраза.  Нередко в результате метаболизма вещества на первом этапе образуются промежуточные продукты, обладающие высокой биологической активностью (табл. 8). Таблица 8.  ^ Примеры биотрансформации ксенобиотиков с образованием активных промежуточных продуктов в ходе l фазы метаболизма

Исходное вещество	Продукт реакции	Класс соединения	Энзимы
хлороформ	фосген	ацилгалоген	Р-450
аллиловый спирт	акролеин	ненасыщенный альдегид	алкоголь дегидрогеназа
дихлорэтан	хлорацетальдегид	альдегид	Р-450
диметил нитрозамин	ион метилдиазониума	алкил диазониум	Р-450
гексан	гександион	дикетон	Р-450 алкоголь дегидрогеназа
винилхлорид	хлорэтиленэпоксид	эпоксид	Р-450
бенз(а)пирен	бензпирендиолэпоксид	диол эпоксид	Р-450 эпоксидгидролаза пероксидаза
бензол	бензохинол	хинол	Р-450 пероксидаза
тетрахлор метан	тетрахлорметил-радикал	алкильный радикал	Р-450
р-аминофенол	р-бензохинонимин	хинонимин	пероксидаза

Большинство энзимов первой фазы локализованы в гладком эндоплазматическом ретикулуме клетки (микросомальные энзимы); часть - в растворимой фазе цитозоля (алкоголь-, альдегиддегидрогеназа, эстеразы). Некоторые гидролазы содержатся в плазме крови (карбоксилэстераза, арилэстераза).

ГЛАВА 4.4. МЕТАБОЛИЗМ КСЕНОБИОТИКОВ

Многие ксенобиотики, попав в организм, подвергаются биотрансформации и выделяются в виде метаболитов. В основе биотрансформации по большей части лежат энзиматические преобразования молекул. Биологический смысл явления - превращение химического вещества в форму, удобную для выведения из организма, и тем самым, сокращение времени его действия.

Метаболизм ксенобиотиков проходит в две фазы (рисунок 1).

Рисунок 1. Фазы метаболизма чужеродных соединений

В ходе первой фазы окислительно-восстановительного или гидролитического превращения молекула вещества обогащается полярными функциональными группами, что делает ее реакционно-способной и более растворимой в воде. Во второй фазе проходят синтетические процессы конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, в результате чего образуются полярные соединения, которые выводятся из организма с помощью специальных механизмов экскреции.

Разнообразие каталитических свойств энзимов биотрансформации и их низкая субстратная специфичность позволяет организму метаболизировать вещества самого разного строения. Вместе с тем, у животных разных видов и человека метаболизм ксенобиотиков проходит далеко не одинаково, поскольку энзимы, участвующие в превращениях чужеродных веществ, часто видоспецифичны.

Следствием химической модификации молекулы ксенобиотика могут стать:

1. Ослабление токсичности;

2. Усиление токсичности;

3. Изменение характера токсического действия;

4. Инициация токсического процесса.

Метаболизм многих ксенобиотиков сопровождается образованием продуктов существенно уступающих по токсичности исходным веществам. Так, роданиды, образующиеся в процессе биопревращения цианидов, в несколько сот раз менее токсичны, чем исходные ксенобиотики. Гидролитическое отщепление от молекул зарина, зомана, диизопропилфторфосфата иона фтора, приводит к утрате этими веществами способности угнетать активность ацетилхолинэстеразы и существенному понижению их токсичности. Процесс утраты токсикантом токсичности в результате биотрансформации обозначается как "метаболическая детоксикация".

В процессе метаболизма других веществ образуются более токсичные соединения. Примером такого рода превращений является, в частности, образование в организме фторуксусной кислоты при интоксикации фторэтанолом.

В ряде случаев в ходе биотрансформации ксенобиотиков образуются вещества, способные совершенно иначе действовать на организм, чем исходные агенты. Так, некоторые спирты (этиленгликоль), действуя целой молекулой, вызывают седативно-гипнотический эффект (опьянение, наркоз). В ходе их биопревращения образуются соответствующие альдегиды и органические кислоты (щавелевая кислота), способные повреждать паренхиматозные органы и, в частности, почки. Многие низкомолекулярные вещества, являющиеся факультативными аллергенами, подвергаются в организме метаболическим превращениям с образованием реакционноспособных промежуточных продуктов. Так, соединения, содержащие в молекуле амино- или нитрогруппу в ходе метаболизма превращаются в гидроксиламины, активно взаимодействующие с протеинами крови и тканей, формируя полные антигены. При повторном поступлении таких веществ в организм помимо специфического действия развиваются аллергические реакции.

Порой сам процесс метаболизма ксенобиотика является пусковым звеном в развитии интоксикации. Например, в ходе биологического окисления ароматических углеводородов инициируются свободно-радикальные процессы в клетках, образуются ареноксиды, формирующие ковалентные связи с нуклеофильными структурами клеток (белками, сульфгидрильными группами, нуклеиновыми кислотами и т.д), активирующие перекисное окисление липидов биологических мембран (рисунок 2). В итоге инициируется мутагенное, канцерогенное, цитотоксическое действие токсикантов.

Рисунок 2. Образование ареноксидов в процессе метаболизма ароматических полициклических углеводородов при участии оксидаз смешанных функций (ОСФ)

Аналогично ареноксидам на клетки действуют N-оксиды, нитрозамины, гидроксиламины, также являющиеся канцерогенами и мутагенами. В опытах на собаках установлена прямая зависимость между канцерогенной активностью (рак мочевого пузыря) и концентрацией в моче продуктов N-окисления веществ в ряду: 1-нафтиламин, 2-нафтиламин, 4-аминодифенил.

По такому же механизму действуют на организм галогенированный бензол, нафтанол и многие другие ксенобиотики.

Процесс образования токсичных продуктов метаболизма называется "токсификация", а продукты биотрансформации, обладающие высокой токсичностью - токсичными метаболитами. Во многих случаях токсичный метаболит является не стабильным продуктом, подвергающимся дальнейшим превращениям. В этом случае он также называется промежуточным или реактивным метаболитом. Реактивные метаболиты это как раз те вещества, которые часто и вызывают повреждение биосистем на молекулярном уровне. Общим свойством практически всех реактивных метаболитов является их электродефицитное состояние, т.е. высокая электрофильность. Эти вещества вступают во взаимодействие с богатыми электронами (нуклеофильными) молекулами, повреждая их. К числу последних относятся макромолекулы клеток, в структуру которых входят в большом количестве атомы кислорода, азота, серы. Это, прежде всего, белки и нуклеиновые кислоты. Реактивные метаболиты либо присоединяются к нуклеофильным молекулам, образуя с ними ковалентные связи, либо вызывают их окисление. В обоих случаях структура макромолекул нарушается, следовательно, нарушаются и их функции.

Биоактивация далеко не всегда сопровождается повреждением биосубстрата, поскольку одновременно в организме протекают процессы детоксикации и репарации. Интенсивность этих процессов может быть достаточной для компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов. Тем не менее при введении высоких доз токсиканта, повторном воздействии защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что и приведет к развитию токсического процесса.

Разнообразие чужеродных химических веществ, способных подвергаться в организме метаболическим превращениям, является следствием многообразия энзимов, участвующих в l фазе биотрансформации и их низкой субстратной специфичности. Многие из энзимов существуют в нескольких формах (изоферменты), различающихся по своим физико-химическим свойствам (молекулярная масса, электрофоретическая подвижность, абсорбцией света с разними длинами волн), отношению к индукторам и ингибиторам (см. ниже) и активностью в отношении субстратов различного строения.

Энзимы l фазы, участвующие в процессе биотрансформации ксенобиотиков, можно классифицировать в соответствии с типом активируемой ими реакции:

1. Оксидазы смешанной функции: цитохромР-450 (Р-450) и флавинсодержащие монооксигеназы (ФМО);

2. Простогландинсинтетазы - гидропероксидазы (ПГС) и другие пероксидазы;

3. Алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы;

4. Флавопротеинредуктазы;

5. Эпоксидгидролазы;

6. Эстеразы и амидазы.

12. Метаболизм ксенобиотиков

Объекты живой природы постоянно вступают в контакт с огромным чис-лом разнообразных химических соединений. Они входят в состав продук-тов питания, содержатся в воде, поступают с вдыхаемым воздухом, и это не только необходимые организму белки, углеводы, жиры, витамины, соли, кислород, но и не представляющие пищевой ценности или даже ток-сичные компоненты естественного (эфирные масла, красители, алкалоиды, таннины, токсины и др.) или искусственного происхождения: консервиру-ющие, вкусовые и ароматизирующие добавки, пестициды, а также остав-шиеся в продуктах питания лекарственные и гормональные препараты, ко-торые добавляли в корм птице или скоту. Независимо от их происхожде-ния, не участвующие в нормальном течении обменных процессов вещест-ва, поступающие в организм, называются ксенобиотиками. Их отрицатель-ное воздействие особенно сильно проявляется в индустриальных зонах с загрязненной окружающей средой.

Поскольку многие ксенобиотики токсичны, живые системы для выжива-ния должны иметь механизмы для их обезвреживания и выведения из тех сред, где идут нормальные метаболические процессы. У растений все отхо-ды жизнедеятельности собираются в вакуолях – окруженных мембраной клеточных образованиях. В вакуолях действуют очень эффективные фер-менты с гидролазной активностью. Нарушение целостности мембраны вакуоли приводит к гибели растительной клетки, так как содержащиеся в ней ферменты разрушают белки и другие гидролизующиеся компоненты цитозоля. Чем старше растительная клетка или чем более насыщена ксено-биотиками среда, в которой она находится, тем большее пространство клетки занимает вакуоль. У животных есть выделительная система, и ксе-нобиотики, так или иначе попавшие в кровь, могут быть выведены через почки. Правда, физиология почек такова, что они переводят в мочу только растворимые в воде вещества. Неполярные гидрофобные вещества образу-ют комплексы с транспортными белками крови и в таком виде почками не выводятся. Из этого следует, что биохимические системы должны пере-водить гидрофобные ксенобиотики в растворимые производные.

Метаболизм ксенобиотиков протекает преимущественно в печени с по-мощью неселективных ферментов. Низкая селективность ферментов, пред-назначенных для метаболизма ксенобиотиков обусловлена тем, что пол-ный набор избирательных ферментов для всех возможных веществ (а их уже синтезировано более 10 миллионов) нереализуем. Предназначенные для метаболического превращения ксенобиотиков ферменты должны быть достаточно универсальными для катализа превращений субстратов с ши-роким набором функциональных групп в широком диапазоне молекуляр-ных масс и пространственных особенностей. Низкая избирательность этих ферментов не позволяет им различать ксенобиотики и эндогенные вещест-ва и поэтому они вызывают превращение и многих необходимых для тече-ния нормальных метаболических процессов субстратов и регуляторов метаболизма. Поэтому при отсутствии в организме ксенобиотиков содер-жание этих ферментов должно быть минимальным, а появление ксенобио-тиков индуцирует усиленный биосинтез этих ферментов.

Здесь уже упомянут серьезный недостаток реализуемой в живой природе системы обезвреживания ксенобиотиков – она атакует любые молекулы, в том числе и такие жизненно важные для организма вещества, как, напри-мер, гормоны, нейромедиаторы, субстраты, метаболиты, белки и многие другие участвующие в обеспечении существования организма молекулы. Но несовершенство системы, предназначенной для биотрансформации ксе-нобиотиков, этим не ограничивается. Введение полярных функциональных групп в инертные и неполярные молекулы чаще всего сопровождается их метаболической активацией с образованием интермедиатов с очень высо-кой реакционной спообностью. Если эти промежуточные соединения не будут полностью трансформированы в течение кратчайшего времени, то появляется риск химического повреждения ими таких биомолекул, как белки, ДНК и РНК. Наибольшую опасность представляют эпоксиды, кар-бониевые ионы, ионы нитрония и другие электрофильные продукты пре-вращений. Они взаимодействуют с белковыми молекулами и с нуклеино-выми кислотами, приводя к истощению иммунной системы, к нарушению нормального течения метаболизма и к мутациям в структуре ДНК. Следст-вием таких сопровождающих метаболизм ксенобиотиков превращений мо-гут быть цирроз печени, раковые заболевания и другие серьезные повреж-дения систем жизнеобеспечения.

В качестве примера можно привести действие неизбирательной моноокси-геназы на женский половой гормон эстрадиол. Его ароматический цикл в результате такого ферментативного окисления превращается в соответст-вующий ареноксид и в результате этого не только снижается концентрация гормона, но, что имеет гораздо более серьезные последствия, идет образо-вание соединения с высокой мутагенной активностью.

Когда в 40-е годы ХХ столетия началось интенсивное исследование хими-ческого канцерогенеза, появилась надежда, что проблема онкологических заболеваний будет решена в кратчайшие сроки. В основе идеи лежали представления о возможности выявления канцерогенных функциональных групп в химических соединениях. Предполагалось, что, исключив возмож-ность контакта людей с такими веществами, можно будет избавиться от этой болезни. Но спектр веществ с канцерогенной активностью постоянно расширяется (канцерогенен даже химически инертный асбест) и, кроме того, химический канцерогенез это всего лишь один из факторов, спо-собствующих возникновению этой болезни. На современном уровне пони-мания проблемы можно утверждать, что одной из причин возникновения злокачественных опухолей является метаболическая активация поступаю-щих в организм веществ под действием клеточных ферментов с образова-нием промежуточных продуктов, которые могут взаимодействовать с нуклеофильными центрами в ДНК.

Мутагенная активность веществ может быть выявлена в достаточно простом опыте на мутантной форме бактерии Salmonella, которая нужда-ется для роста в гистидине. Для проверки такой штамм наносят на пита-тельную среду, лишенную гистидина и прибавляют исследуемое вещество или исследуемое вещество вместе с гомогенизированными клетками пече-ни крысы. Если в присутствии вещества появляются колонии бактерий, которые могут жить без гистидина (прошла обратная мутация), то это означает, что само вещество является мутагеном. Если же такие колонии появляются только при совместном действии исследуемого вещества и гомогенизата клеток печени, то это означает, что мутагенная активность является следствием метаболической активации этого вещества. Точность теста (Б.Эймс) достигает 90 %.

Большинство наших представлений о реакциях, сопровождающих метабо-лизм ксенобиотиков, является результатом изучения метаболических пре-вращений лекарственных веществ. Эти метаболические превращения носят общий характер для всех теплокровных, хотя, конечно, существуют и определенные количественные различия как между видами, так и между отдельными особями одного вида. На уровне отдельных индивидов важ-ную роль в метаболизме ксенобиотиков играют генетические факторы, возраст, пол, гормональный баланс, различие в микрофлоре желудочно-кишечного тракта, перенесенные болезни (особенно, если это болезни печени), образ жизни и т.д.

Один из вариантов классификации путей метаболизма ксенобиотиков был предложен Вильямсом. Он выделил две категории превращений. В первой фазе в молекулу вещества вводятся новые функциональные группы или модифицируются существующие. Во второй фазе происходит присоедине-ние по появившимся в результате первичного превращения функциональ-ным группам высокополярных, часто ионных, структурных элементов, например, остатков глюкуроновой кислоты, серной кислоты, аминокислот-ных остатков. В результате такого сочетания повышается растворимость трансформированного вещества в воде и становится возможным его выве-дение через почки. Подавляющее большинство поступающих в организм ксенобиотиков проходит обе фазы метаболического превращения.

Самый распространенный тип реакций первой фазы представлен реакция-ми окисления. Они протекают в присутствии монооксигеназ или, иначе, оксидаз смешанных функций, называемых также цитохромами Р₄₅₀(450 нм – это длина волны поглощаемого комплексом цитохрома и монооксида углерода света). Надо сразу сказать, что наряду с неизбирательными моно-оксигеназами, катализирующими окисление ксенобиотиков, в организме есть также избирательные ферменты этого семейства, обеспечивающие, например, превращение фенилаланина в тирозин и далее в адреналин, участвующие в биосинтезе и в превращениях стероидов (гормоны, компо-ненты мембран) и т. д.

Оксидазами смешанных функций эти ферменты называют потому, что в их работе участвует восстановительный потенциал в виде NADРН. ЭтиNADРН-зависимые ферменты катализируют большое число реакций гидр-оксилирования, эпоксидирования и другие превращения, используя в ка-честве окислителя молекулу кислорода. При этом один атом кислорода встраивается в субстрат, а второй окисляетNADРН с образованием воды. В активном центре фермента молекула кислорода связывается с атомом железа гемового кофермента и активируется для реакции с органическим субстратом. Активированный атом кислорода встраивается по связям С-Н,N-Н.S-Н, С=С и т.д. Одно из представлений механизма этого процесса иллюстрируется следующей схемой:

Монооксигеназа с окисленным гемом связывает в активном центре субст-рат RHи после одноэлектронного восстановления атома железа в геме флавопротеиновым (FP) и никотинамидадениндинуклеотидфосфатным (NADPH+H⁺) комплексом связывается с молекулой кислорода, после этого один из атомов активированного кислорода при участии того же комплекса коферментов восстановления окисляет субстрат, а второй атом кислорода восстанавливается до воды. После этого окисленный субстрат покидает активный центр фермента, куда снова поступает ксенобиотик. Окисленное железо восстанавливается и система возвращается в исходное состояние.

Обеспечивающая окислительную трансформацию ксенобиотиков фермент-ная система цитохрома Р₄₅₀, как уже говорилось выше, относится к инду-цируемым ферментам. Это значит, что содержание фермента и его актив-ность повышаются в ответ на появление в организме ксенобиотиков. Для этого используется обычный механизм активации генов, отвечающих за биосинтез белков. Прошедший через липидный слой мембраны гидро-фобный ксенобиотик связывается с рецепторным белком, в виде такого комплекса проходит в ядро клетки и запускает процесс транскрипции на соответствующем участке хромосомы. Образовавшаяся РНК покидает ядро и становится матрицей для синтеза белковой составляющей моно-оксигеназы. Индукторами монооксигеназ являются полициклические аро-матические углеводороды, многие лекарственные вещества, например фенобарбитал, входящие в состав продуктов питания флавоны, произ-водные индола, ксантины и др. Монооксигеназы локализованы в гладком эндоплазматическом ретикулуме клетки, который при гомогенизации тка-ни печени образует микросомы (отсюда еще одно название этих моноокси-геназ – микросомальные оксигеназы).

В реакциях биохимического окисления алканов и алкильных остатков сложных молекул гидроксилированию подвергаются концевые группы или предпоследний атом углерода в цепи. Так, например, основным продуктом метаболического превращения гексана является гексан-2-ол. С соединени-ями, содержащими функциональные группы, реакция идет по функцио-нальной группе или по ближайшему к функциональной группе атому углерода, например

В соответствии с этим олефины окисляются в аллильное положение или эпоксидируются, а анизол окисляется по метильной группе с образованием полуацеталя, который распадается на фенол и формальдегид, то есть идет реакция О-деалкилирования:

По аналогичной схеме фенацетин деалкилируется с образованием парацет-амола (панадол):

Ароматические углеводороды также окисляются в реакциях с участием цитохромов Р₄₅₀. Бензол и многие замещенные бензолы превращаются при этом в фенолы. Сначала предполагалось, что реакция протекает просто за счет внедрения атома кислорода по С Н-связи, но затем было показано, что промежуточными продуктами этой реакции являются ареноксиды. Перегруппировка ареноксидов в фенолы илиNIH-сдвиг (NationalInstituteofHealth) протекает без участия ферментов:

Это было доказано элегантными опытами с дейтериевыми метками. NIH-Сдвиг включает гетерогенный разрыв одной из связей эпоксида, сдвиг гид-ридиона и таутомерное превращение образовавшегося ненасыщенного ке-тона с восстановлением ароматической структуры. Образующийся из бен-зола ареноксид это сильнейший алкилатор, его токсическое действие осо-бенно ярко проявляется на клетках костного мозга, поэтому везде, где это возможно, бензол надо заменять толуолом. В отличие от бензола толуол окисляется монооксигеназами с образованием гораздо менее токсичного бензилового спирта.

В аминах окисление может идти как по атомам углерода, так и по атому азота. В первом случае идет реакция деалкилирования, а во втором образуются токсичные гидроксиламины, например:

Третичные амины могут быть окислены до N-оксидов. Одним из серьез-ных экологических загрязнителей является 3,4,3,4-тетрахлоразобензол, образующийся в природе из агрохимических препаратов на основе 3,4-ди-хлоранилина. Этот замещенный азобензол является индуктором образова-ния монооксигеназ, но его ферментативное окисление по пассивирован-ным заместителями С-Н-связям практически не идет. В организме тепло-кровных он превращается вN-оксид, который снова легко восстанав-ливаетсяNADH-зависимыми ферментами в соответствующий азобензол. Из-за этого его превращение в растворимую в воде форму оказывается не-возможным и он накапливается в организме, создавая при этом повышен-ный фон монооксигеназ, что, как уже говорилось выше, приводит к исто-щению ресурса иммунной системы и ко всему спектру связанных с этим заболеваний, включая злокачественные опухоли.

Атомы серы в ксенобиотиках и в различных биохимических структурах легко окисляются монооксигеназами. Лекарственный препарат хлорпром-азин (аминазин), используемый для лечения некоторых психических забо-леваний, окисляется цитохромами Р₄₅₀до соответствующего сульфоксида:

Второй тип реакций первой фазы биотрансформации ксенобиотиков – это восстановление. Этот тип превращений встречается гораздо реже, чем окисление, но он важен для перевода в амины нитро- и азосоединений. Восстановление нитрогрупп катализируется нитроредуктазами и оно также идет с промежуточным образованием токсичных нитрозосоединений и гидроксиламинов.

Восстановительное расщепление азогруппы было изучено на примере азо-красителя красного цвета пронтозила («красный стрептоцид»), показав-шего хорошие бактерицидные свойства. Оказалось, что сам краситель малоактивен, но в бактериях он легко восстанавливается с разрывом связей между атомами азота и превращается в триаминобензол и бактерицидный амид сульфаминовой кислоты («белый стрептоцид»), который представ-ляет собой антиметаболит п-аминобензойной кислоты, участвующей в бак-териях в биосинтезе фолиевой кислоты: