32. Иммуноблотинг. Механизм и применение.

Метод идентификации Аг или АТ с помощью соотв. известных сывороток или Аг. На практике применяется для выявления спектра антител к антигенным смесям Относится к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Принцип метода на примере выявления антител к ВИЧ Реакция проводится в несколько этапов:

1) Антигены, экстрагированные из исследуемого объекта — ВИЧ (белки-р гликопротеины-др), подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле — разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2) Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной, и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигена.

Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге Мембрану разрезают на полоски (стрипы).

3) Стрип с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4) Сгрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.

5) Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют зоне локализации комплекса АГ-АТ.

33. Типы вакцин. Получение живых, убитых, субъединичных и рекомбинантных

вакцин. Проверка их безвредности, реактогенности и иммуногенности.

По природе составляющих компонентов вакцины разделяют на живые, убитые, химические,

анатоксины. Живые гетеровакцины при введении в организм вызывают лёгкие формы

заболевания, прекрасно защищающие от более тяжёлых формю Например, вакуина против

коровьей оспы позволяет создать иммунитет против натуральной оспы. Живые ослабленные

(аттенуированные) вкцины содержат изменённые формы возбудителей инфекционных

заболеваний (вакцинные штаммы, которые потеряли вирулентные свойства, но сохранили

способность индуцировать выработку иммунитета). Снижение вирулентности осуществляется следующими основными методами:

а)культивирование бактерий на средах с изменённым составом или температурой (вакцины

против туберкулёза, сибирской язвы, чумы, туляремии);

б) пассаж микроорганизма через организм невосприимчивых или маловосприимчивых

животных (антирабическая вакцина);

в) создание в лабораторных условиях штаммов-рекомбинантов.

Кроме этих методов, используются выявление и селекция штаммов возбудителей, потерявших в естественных условиях вирулентность для человека. Живые вакцины вызывают субклиническое заболевание и обеспечивают эффективную защиту. В то же время они могут стать тяжёлых персистентных инфекций, вызвать поражение генетического аппарата клеток. Поэтому при иммунизации людей с иммунодефицитными состояниями необходима максимальная осторожность.

Убитые корпускулярные вакцины (инактивированные) получают из свежевыделенных

вирулентных и иммуногенных штаммов возбудителей, инактивированных температурой,

либо с помощью химических веществ. В зависимости от применяемого химического

вещества различают формоловые, спиртовые, ацетоновые, мертиолятные, хлороформенные

вакцины. Убитые вакцины безопаснее живых, но менее эффективныи требуют повторного

введения (ревакцинаций). В настоящее время применяются убитые вакцины против

коклюша, холеры, лептоспирозов, клещевого энцефалита и др.Субъединичные вакцины (Инфлювак, Гриппол, Агриппал) состоят лишь из двух поверхностных вирусных белков, гемагглютинина и нейраминидазы, которые наиболее важны для индукции иммунного ответа против гриппа. Остальные белки вириона и куриного эмбриона удаляются при очистке. Для создания любой субъединичной вакцины прежде всего нужно идентифицировать те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В ответ на введение этого гликопротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие ин-тактный HSV (вирус простого герпеса).

Рекомбинантные вакцины - вакцины, полученные с помощью генной инженерии. В

генетический аппарат неболезнетворного вируса встраивают участок ДНК болезнетворного

вируса.

Проверка вакцин. Безвредность включает проверку на лабораторных животных и других

биологических системах токсичности, пирогенности, стерильности, аллергенности,

тератогенности, мутагенности препарата. Реактогенность, т.е. побочные местные и общие

реакции на введение В., оценивают на животных и при прививках людей. Иммуногенность

проверяют на лабораторных животных и выражают в иммунизирующих единицах, т.е. в

дозах антигена, защищающих 50% иммунизированных животных, зараженных

определенным числом инфицирующих доз патогенного микроба или токсина. В

противоэпидемической практике эффект вакцинации оценивают по соотношению

инфекционной заболеваемости в привитых и непривитых коллективах.