Косвенные методы определения соматических клеток

Косвенно соматические клетки определяют с помощью диагности­ческих реактивов мастидина, димастина, мастоприма, пробы Уайтсайда, содержащих поверхностно-активные вещества (ПАВ). ПАВ разруша­ют мембраны клеток, высвобождают из ядер ДНК и вступают с ней в реакцию, образуя желе. По степени образования желеобразного сгустка косвенно судят о количестве соматических клеток в молоке. Реакцию молока с диагностическим реактивом проводят на молочно-контрольных пластинках ПМК-1 или ПМК-2, имеющих 4луночки, соответственно долям вымени коровы, определение соматических клеток с помощью диагностических реактивов проводят в молоке из отдельных долей вымени или удоя коровы для диагностики субклинического мастита и пробах сборного молока для определения в нем примеси анормального.

Для диагностики мастита по молоку из каждой доли вымени используют диагностические реактивы малой концентрации: мастидин 2%,димастин 5%, мастоприм I%,в пробе Уайт-Сайда 4%раствор едкого натра.

Для диагностики мастита у коров по молоку разового или суточного удоя используют 10% раствор димастидина и 20%димастина, а для определения примеси анормального молока в сборном -2,5% раствор мастоприма и маститодиагност (реактив Загаевского).

Наличие в составе мастидина, кроме ПАВ, индикатора бромкрезолпурина, а в димастине фенолового красного, позволяет судить по изменению цвета смеси о величине рН исследуемого молока.

При использовании этих реактивов для диагностики субклини­ческого мастита основным диагностическим признаком является обра­зование желеобразного сгустка, а изменение цвета смеси –ориентирующим.

Проба с 2% раствором мастидина.Для приготовления 2% раствора мастидина к 100мл 10% раствора, выпускаемого отечественной промышленностью, прибавляют 400мл дистиллированной или прокипяченной воды.

В луночки молочно-контрольной пластинки (ПМК-1, ПМК-2) из соответствующих долей вымени надаивают по 1мл молока и добавляют1мл приготовленного 2% раствора мастидина с помощью пипетки-ав­томата или дозатора жидкости. Смесь молока с реактивом перемеши­вают палочкой в каждой луночке ПМК-1 поочередно в течение 10-15 с. При использовании ПМК-2 смешивание молока с реактивом проводят одновременно во всех луночках, путем ротационного вращения плас­тинки в горизонтальной плоскости.

Реакцию учитывают по густоте желе:

отрицательная реакция (-) -однородная жидкость:

сомнительная реакция (±) -следы образования желе;

положительная реакция (+) -ясно видимый сгусток, который можно выбросить из луночки палочкой при перемешивании.

На пластинке ПМК-2 при отрицательной реакции (-)образуется однородная смесь. При сомнительной реакции (±) во время вращения пластинки на дне луночки заметны тонкие нити (тяжи) без тенденции образования сгустка. Положительная реакция (+) -отчетливое появ­ление слабого или быстро образующегося плотного сгустка, концент­рирующегося при вращении пластинки в центре луночки.

Определение рН молока по цвету:

светло-сиреневый, дымчатый -рН молока нормальная (6,5-6,8);

почти белый -повышенная кислотность молока (рН меньше 6,5);

темно-сиреневый -повышенная щелочность молока (рН больше 8).

Проба с 5% раствором димастина. Раствор димастина готовят на дистиллированной или прокипяченной теплой воде.

Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2% раствором мастидина.

Определения рН молока по цвету:

оранжевый, оранжево-красный (красно-оранжевый) –нормальная реакция молока (рН 6,5-6,8);

желтый -повышенная кислотность молока (рН меньше 6,5);

красный -повышенная щелочность молока (рН больше 6,8);

алый и малиновый -ярко выраженная щелочность молока (рН больше 7,0).

Проба с I% раствором мастоприма. Препарат мастоприм представляет собой порошок желтоватого цвета, состоящий из смеси сульфанола (4части) с едким натром (1 часть). Раствор мастоприма готовят на дистиллированной воде.

Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2%раствором мастидина.

Проба Уайтсайда.Готовят 4%раствор едкого натра на дистиллированной воде, который добавляют по 2,5мл к молоку (по 1мл) в каждую луночку молочно-контрольной пластинки.

Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2%раствором мастидина.

Спустя 30с. признаки желеобразования могут исчезнуть.

Проба с 10% раствором мастидина. Диагностику мастита у коров по молоку разового или суточного удоя проводят при контрольных дойках и взятии проб для определе­ния жира и других показателей молока. Молоко в количестве 1мл берут из молокомера или суточной пробы и выливают в луночку молочно-контрольной пластинки. Затем добавляют 1мл 10% раствора мастидина.

Техника постановки пробы на пластинках ПМК-1 и ПМК-2 и учет реакции по образованию желе и цвету проводят как указано раньше.

Для определения пораженной доли вымени от животных, давших положительную и сомнительную реакцию с 10%раствором мастидина, отбирают пробы молока из каждой четверти и исследуют с 2%раство­ром мастидина, или 5% раствором димастина, или 1%раствором мастоприма, или пробой Уайтсайда.

Проба с 20% растворам димастина. Постановку пробы и учет реакции проводят как с 5% раствором.

Соответствие количества соматических клеток (млн./мл), подс­читанных по методу Прэскотта-Брида, показаниям реакции молока из долей вымени коров с 2%раствором мастидина и 5%раствором димас­тина по данным А.И.Ивашуры, представлены в таблице 2:

Таблица. 2.

Соответствие количества соматических клеток показаниям реакции молока

Реактив	Реакция с реактивом; количество СК
	-	+/-	+
Мастдин	213408	1168248 -3752443	6987531 -21179849
Димстин	107230	1656400 -4759550	9279290 -27936675

Проба с 2,5% раствором мастоприма. Примесь анормального молока в сборном определяют на молокоперерабатывающих предприятиях.

В луночки молочно-контрольной пластинки ПМК-1вносят 1 мл тщательно перемешанного молока и добавляют к нему 1мл 2,5%раст­вора мастоприма. Молоко с реактивом перемешивают в течение 10 -15с и учитывают реакцию.

На пластинке ПМК-1 при отрицательной реакции жидкость одно­родная, желе не образуется. Такое молоко не имеет примеси анор­мального молока или примесь незначительная (2-З%).

Положительная реакция -образуется желеобразный сгусток, степень которого оценивается в крестах.

Один крест (+) -слабое желе, смесь молока с реактивом тя­нется за палочкой в виде нити, на дне уже заметна небольшая выем­ка. Такое молоко содержит в среднем 4-б%анормального молока и до500тыс./мл соматических клеток.

Два креста (++) -более выраженный желеобразный сгусток, при перемешивании которого хорошо видна выемка, но желе из луночки еще не удается выбросить. Такое молоко содержит в среднем 9-10% анормального молока и от 500тыс. до 1млн./мл соматических кле­ток.

Три креста (+++) -хорошо сформированный желеобразный сгусток, который легко можно выбросить палочкой из луночки пластинки. Такое молоко содержит выше 15%анормального молока и свыше1млн./мл соматических клеток.

Проба с маститодиагностом (реактив Загаевского). Для приготовления маститодиагноста 300г сульфанола и 50г триполифосфата натрия растворяют в 1л дистиллированной воды при температуре 70-75°С. После полного растворения смеси и охлажде­ния до 20-25°С добавляют 0,2г бромтимолового синего и 3мл 1% спиртово-водного раствора розоловой кислоты и тщательно перемеши­вают в течение 3-5мин, после чего реактив фильтруют через ватный фильтр.

Срок хранения приготовленного реактива - 3-3,5месяца при температуре 5°С.

Для исследования берут 2 мл тщательно перемешанного сборного молока, вносят в луночку молочно-контрольной пластинки ПМК-1, до­бавляют 1мл маститодиагноста и перемешивают палочкой в течение5-10с.

Учет реакции проводят по изменению консистенции и цвета сме­си молока с реактивом.

Гомогенная смесь молока с реактивом (-) -отсутствие примеси анормального молока в сборном.

Наличие единичных слизистых тяжей и хлопьев (±) -примесь анормального молока 1-5%.

Умеренное содержание жидкой слизи и хлопьев (+) - примесь анормального молока 5-10%.

Наличие слизи жидкой консистенции (++) -примесь анормально­го молока 10-15%.

Умеренный сгусток в виде белка куриного яйца (+++) -примесь анормального молока 20-25%.

Плотный желеобразный сгусток, зеленоватого цвета (++++)-примесь анормального молока свыше 25%.

Примесь более 10% анормального молока к сборному влияет на его технологическую переработку, качество изготовляемых из него кисломолочных продуктов и сыров.