Глава4. Физиология микроорганизмов

Как все живые существа, микроорганизмы осуществляют процес­сы питания, дыхания, роста и размножения. В то же время для мик­роорганизмов характерны некоторые особенности, отличающие их от высших организмов. Будучи одноклеточными, микроорганизмы самос­тоятельно осуществляют все жизненные процессы, и регуляция этих про­цессов заложена в каждой клетке.

Химический состав микроорганизмов

Значительную часть клетки составляет вода - от 70 до 85% от об­щей массы. Вода служит средой, в которой протекают разнообразные химические процессы микробной клетки. В ней растворяются кристал­лоиды, диссоциируют электролиты, формируются коллоиды. Кроме того, сама вода как химический компонент, непосредственно участву­ет в реакциях гидролиза белков, углеводов и липоидов. Количество воды в клетке постоянно, и это постоянство регулируется цитоплазматической мембраной.

Сухой остаток микробной клетки составляет от 15% до 30%. Из них половина приходится на белки. Это простые белки - протеины и сложные белки - протеиды. Аминокислотный состав белков характе­рен для различных видов микроорганизмов. Белки входят в состав ферментов. Белками являются экзотоксины, с которыми связана патогенность целого ряда микробов; белками являются многие антигены, с ними связана специфичность микробов.

Нуклеиновые кислоты являются важнейшими компонентами микробов. В ДНК зашифрована вся наследственная информация клет­ки, а РНК участвует в процессах считывания информации, передачи се на рибосомы и синтеза в них белка - соответственно: матричная РНК (мРНК), рибосомальная РНК (рРНК) и транспортная РНК (тРНК).

Установлено, что состав нуклеотидов ДНК, а именно соотноше­ния гуанин + цитозин/аденин + тимин является стабильным признаком. Поэтому его можно использовать для определения таксономического положения бактерий. Например, у стафилококков процентное содер­жание Г+Ц-28%-39%, а у сходных с ними микрококков Г+Ц=65%-83%, следовательно, они принадлежат к разным родам.

Липиды у бактерий, не содержащих жировые вещества в виде вклю­чений, составляют около 10% сухого остатка. У бактерий, имеющих особые жировые включения, например, у микобактерий туберкулеза, количество липидов достигает 40%, что обеспечивает этим бактериям устойчивость к кислотам, щелочам, спиртам. В состав липидов входят нейтральные жиры, фосфолипиды и свободные жирные кислоты. Фосфолипиды являются составной частью цитоплазматической мембра­ны, принимают участие в транспорте веществ. Липиды входят в со­став липополисахарида клеточной стенки грамотрицательных бакте­рий - это их эндотоксин и О-антиген.

Углеводы выполняют в клетке пластическую роль и являются ис­точником энергии, необходимым для обменных процессов. Количество углеводов в клетке непостоянно даже у одной и той же бактерии (от 10% до 30%) и зависит не только от рода и вида, но и от условий разви­тия микробов. Бактерии содержат моносахариды, дисахариды, полисахариды. У некоторых бактерий полисахаридный антиген настолько специфичен, что позволяет разграничить отдельные типы внутри вида. Например, капсульный антиген пневмококков, поверхностный С-антиген стрептококков.

Минеральные вещества микроорганизмов разнообразны, коли­чество и состав их зависит от вида микробов и состава питательной среды. Основные элементы, необходимые для жизнедеятельности клет­ки - натрий, калий, фосфор, кальций, магний, железо, медь, сера, хлор, кремний. Некоторые металлы - железо, кальций - входят в состав фер­ментов. Фосфор входит в состав аденозинтрифосфорной кислоты, ко­торая является своеобразным аккумулятором энергии. Ионы металлов участвуют в поддержании постоянства осмотического давления, реак­ции среды (рН) в клетке. Реакция цитоплазмы слабощелочная. Заряд на поверхности бактерий - отрицательный, у спирохет - положитель­ный. Благодаря одноименному заряду, бактерии в физрастворе обра­зуют равномерно-мутную взвесь. Склеивание их между собой и обра­зование хлопьев наблюдается при реакции агглютинации, а также при потере поверхностного заряда клетки, например, у шероховатых R-форм бактерий.

Метаболизм (обмен веществ) микроорганизмов

Питание микробов (конструктивный метаболизм).

Как у всего живого, метаболизм микроорганизмов состоит из двух взаимосвязанных, одновременно протекающих, но противоположных процессов - анаболизма, или конструктивного метаболизма, и катабо­лизма, или энергетического метаболизма.

Обмен веществ у микроорганизмов имеет свои особенности.

1) Быстрота и интенсивность обменных процессов. За сутки мик­робная клетка может переработать такое количество питательных ве­ществ, которое превышает ее собственный вес в 30-40 раз.

2) Выраженная приспособляемость к изменяющимся условиям внешней среды.

3) Питание осуществляется через всю поверхность клетки. Прокариоты не проглатывают питательные вещества, не переваривают их внутри клетки, а расщепляют их вне клетки с помощью экзоферментов до более простых соединений, которые транспортируются в клетку.

Для роста и жизнедеятельности микроорганизмов обязательно на­личие в среде обитания питательных материалов для построения ком­понентов клетки и источники энергии. Для микробов необходимы вода, источники углерода, кислорода, азота, водорода, фосфора, калия, на­трия и других элементов. Требуются также микроэлементы: железо, марганец, цинк, медь для синтеза ферментов. Различные виды микро­бов нуждаются в тех или иных факторах роста, таких, как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания.

В зависимости от способности усваивать органические или не­органические источники углерода и азота микроорганизмы делятся

на две группы - аутотрофов и гетеротрофов.

Аутотрофы (греч. autos - сам, trophic - питающийся) получают уг­лерод из углекислоты (СО₂) или ее солей. Из простых неорганических соединений они синтезируют белки, жиры, углеводы, ферменты.

Гетеротрофы (греч. heteros - другой, trophic - питающийся) исполь­зуют сложные органические соединения, такие как углеводы, спирты, аминокислоты, органические кислоты. Среди гетеротрофных микро­организмов различают сапрофитов (греч. sapros - гнилой, phyton - рас­тение) и паразитов. Сапрофиты используют мертвые органические соединения. Они широко распространены в природе, разлагают органи­ческие вещества, отбросы, участвуя таким образом в санитарной очи­стке окружающей среды. Паразиты живут и размножаются в тканях человека, животных, растений.

Микробы могут изменять свой тип питания с паразитического на сапрофитный. Их можно культивировать вне организма, на пита­тельных средах. Среди прокариотов исключение составляют риккетсии и хламидии, которые могут жить только в живых клетках хозяина. Их называют строгими, или облигатными паразитами (лат. obligatus - обязательный). Облигатными паразитами являются также все вирусы.

Транспорт питательных веществ

Через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки прокариотов проникают только небольшие молекулы, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры вначале расщепляются экзоферементами до более простых соединений, которые транспорти­руются внутрь клетки.

Проникновение питательных веществ в клетку происходит с по­мощью различных механизмов.

Пассивная диффузия - вещества поступают в клетку за счет диф­фузии по градиенту концентрации, то есть вследствие того, что кон­центрация вне клетки выше, чем внутри.

Облегченная диффузия - также совершается по градиенту кон­центрации, но с участием ферментов-переносчиков, так называемых пермеаз. Этот фермент присоединяет к себе молекулы вещества на внеш­ней стороне цитоплазматической мембраны и отдает его на внутрен­ней стороне в неизмененном виде. Затем свободный переносчик пере­мещается снова к наружной стороне мембраны, где связывает новые молекулы вещества. При этом каждая пермеаза переносит какое-то определенное вещество.

Эти два механизма переноса не требуют энергетических затрат.

Активный перенос происходит также с участием пермеаз, причем осуществляется против градиента концентрации. Микробная клетка может накопить вещество в концентрации, в тысячи раз превышаю­щих ее во внешней среде. Такой процесс требует затрат энергии, то есть расходуется АТФ.

Транслокация радикалов - это четвертый механизм передачи ве­ществ. Это активный перенос химически измененных молекул, с учас­тием пермеаз. Например, такое простое вещество, как глюкоза, пере­носится в фосфорилированном виде.

Выход веществ из бактериальной клетки происходит путем пас­сивной диффузии или путем облегченной диффузии с участием пермеаз.

Ферменты

Ферменты - катализаторы биологических процессов. Характер­ным свойством ферментов является их специфичность. Каждый фер­мент участвует только в определенной реакции с определенным хи­мическим соединением.

Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окру­жающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называ­ются экзоферментами. К экзоферментам относится также беталактамаза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные анти­биотики, защищая бактерии от их действия.

Эндоферменты участвуют в процессах метаболизма внутри клетки.

Для бактерий, в силу их малых размеров, характерна высокая сте­пень саморегуляции продукции ферментов. В этом отношении фермен­ты можно разделить на конститутивные и адаптивные. Конститутив­ные ферменты продуцируются клеткой постоянно. Адаптивные фер­менты, в свою очередь, подразделяются на индуцируемые и ингибируемые. Продукция индуцируемых ферментов происходит в присутствии субстрата. Например, ферменты, расщепляющие лактозу, образуются в клетке в только присутствии этого углевода. Продукция ингибируемых ферментов, напротив, подавляется присутствием в среде конеч­ного субстрата в достаточно большой концентрации (например, трип-тофана).

Многие патогенные бактерии, кроме ферментов обмена, выделя­ют ферменты, являющиеся факторами вирулентности. Например, та­кие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза способствуют проникновению и распространению патогенного микроба в организме.

Способность бактерий продуцировать определенные ферменты -признак настолько постоянный, что его используют для идентифика­ции, то есть определения вида бактерий. Определяют сахаролитические свойства (ферментацию углеводов) и протеолитические свойства (фер­ментацию белков и пептона).

Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стреп­тококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Ферменты мик­робного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав мою­щих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жировые загрязнения до воднорастворимых веществ, которые легко смываются водой.

Биологическое окисление (энергетический метаболизм)

Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последователь­ном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.

Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кис­лоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.

У микроорганизмов существует два типа биологического окис­ления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кисло­род, и этот процесс называется дыханием в строгом смысле слова. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называет­ся брожением.

Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образова­нием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта

кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.

При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с об­разованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.

При анаэробном типе биологического окисления энергия образу­ется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превра­щается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну моле­кулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.

Микробную природу брожений впервые открыл и доказал Пастер. Изучая маслянокислое брожение, Пастер впервые столкнулся с возможностью жизни без кислорода, то есть с анаэробиозом. Он так­же установил явление, которое впоследствии было названо "эффектом Пастера": прекращение процесса брожения при широком доступе кис­лорода.

Анаэробиоз существует только среди прокариотов. Все микро­организмы по типу дыхания делятся на следующие группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.

Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободно­го кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, хо­лерный вибрион, чудесную палочку. ,

Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при от­сутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислитель­но-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюкозы) до конечных продуктов - СО₂ и Н₂О. Более того, в присутствии свобод­ного кислорода образуются токсические соединения: перекись водо­рода Н₂О₂ и свободный перекисный радикал кислорода О₂. Аэробы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разрушающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и каталазу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размножение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погибают даже при кратковременном контакте с кислородом.

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.

Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор фер­ментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до ко­нечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.

Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших коли­честв кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.

Рост и размножение микроорганизмов

Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной осо­би, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стен­ки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, враста­ющая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется перетяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромо­сомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК раскручивается, каждая нить достраивается комплиментарной нитью и в результате каждая дочерняя клетка получает одну мате­ринскую нить и одну вновь образованную.

Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Боль­шинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии тубер­кулеза делятся медленно - одно деление за 18 часов, спирохеты - одно деление за 10 часов.

Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определен­ного объема и затем каждый час брать пробу и определять количество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить график, на кото­ром по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат лога­рифм количества живых бактерий, то получим кривую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз (рис. 5):

1) латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии адаптируются к пита­тельной среде, количество их не увеличивается;

2) фаза логарифмического ро­ста - количество бактерий увели­чивается в геометрической про­грессии;

3) фаза стационарного роста, во время которой число вновь об­разованных бактерий уравнивает­ся числом погибших, и количество живых бактерий остается постоян­ным, достигая максимального уровня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;

4) фаза отмирания, когда число отмирающих клеток начинает пре­обладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накопления продуктов метаболизма и истощения среды.

Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде на­зывается периодической. Если же в засеянный объем непрерывно подают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жидкости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Непрерывное куль­тивирование применяют в микробиологической промышленности.

Образование микробами пигментов, ароматических веществ. Светящиеся микроорганизмы

Некоторые виды микробов вырабатывают красящие вещества -пигменты. Если пигмент растворим в воде, то окрашенными предс­тавляются и колонии микробов, и питательная среда. Например, си­ний пигмент, выделяемый синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa), окрашивает среду в синий цвет. Пигменты, растворимые в орга­нических растворителях, но нерастворимые в воде, не окрашивают питательную среду. Такой пигмент красного цвета, так называемый продигиозан, растворимый в спирте, выделяет чудесная палочка (Serratia marcescens). К этой же группе относятся пигменты желтого, оранжевого, красного цвета, характерные для кокковой воздушной микрофлоры. У некоторых видов микробов пигменты настолько проч­но связаны с протоплазмой клетки, что не растворяются ни в воде, ни в органических растворителях. Среди патогенных бактерий такие пиг­менты золотистого, палевого, лимонно-желтого цвета образуют ста­филококки.

Цвет пигмента используется для определения вида бактерий.

Некоторые микроорганизмы в процессе метаболизма вырабатыва­ют ароматические вещества. Например, для синегнойной палочки ха­рактерен запах жасмина. Характерный запах сыров, сливочного мас­ла, особый "букет" вина объясняется жизнедеятельностью микробов, которые используются для производства этих продуктов.

Свечение (люминесценция) микробов происходит в результате ос­вобождения энергии при биологическом окислении субстрата. Свечение бывает тем интенсивнее, чем сильнее приток кислорода Светящиеся бактерии были названы фотобактериями. Они придают свечение че­шуе рыб в море, грибам, гниющим деревьям, пищевым продуктам, на поверхности которых размножаются. Свечение может наблюдаться при низких температурах, например, в холодильнике. Патогенных для че­ловека среди фотогенных бактерий не установлено.

Свечение пищевых продуктов, вызванное бактериями, не приво­дит к их порче, и даже может свидетельствовать о том. что в этих про­дуктах не происходит гниения, поскольку оно прекращается при разви­тии гнилостных микроорганизмов.