I Одностадійні та багатостадійні програми
Одностадійні програми передбачають тільки один перехід від початку морфогенеза до його завершення.
Одностадійні програми завжди є елементарними. Поняття елементарності означає неподільність програми на складові частини, її стійкість до парагенетичного впливу: слабкі дії не впливають на хід морфогенеза, а сильні – переривають завершення програми. За кількістю можливих траекторій морфогенеза одностадійні програми діляться на нерозгалужені і розгалужені. В нерозгалуженій програмі закодована тільки одна можлива траекторія морфогенеза. В результаті реалізації такої програми виявляється можливим тільки один нормальний результат розвитку. В розгалуженій програмі закодовані декілька взаємовиключаючих траекторій морфогенеза. В результаті реалізації такої програми виявляється можливим досягнення декількох взаємовиключаючих нормальних результатів розвитку.
Багатостадійні програми включають декілька переходів, кожний з яких завершується досягненням визначеного проміжкового стану (вузла).
Багатостадійні програми можуть буть елементарними та складними. Елементарна програма повинна бути виповнена до кінця, в іншому випадку спостерігається порушення морфогенеза (морфози і терати). В цьому відношенні елементарні програми зовні подібні з одностадійними лінійними програмами. Складові програми засновані на явищі анаболії: кажен наступний проміжковий стан є надбудовою по відношенню до попереднього. При цьому морфогенез може зупинитися при досягненні будь-якого проміжкового стану. В результаті утворюються гіпоморфози – недорозвинені структури.
II Нерозгалужені і розгалужені програми
Нерозгалужені програми передбачають тільки одну траекторію морфогенеза; будь-яке відхилення від цієї траекторії призводить до загибелі організма. Розгалужені програми предбачають існування декількох траекторій морфогенеза.
Розгалуження обумовлено тригерним ефектом – після досягнення визначеного проміжкового стану перед біологічною системою відкривається можливість переключення, або вибору подальшого шляху розвитку (таким чином, тригер можна уявити залізнодорожну стрілку, перевід якої здійснюється диспетчером). Багатостадійні розгалужені програми діляться на деревоподібні та сіткові. В деревоподібних програмах траекторії морфогенеза не пересікаються. Тоді вибір однієї з траекторій морфогенеза в вузлових точках виключає ряд можливих кінцевих результатів. В сіткових програмах траекторії морфогенеза пересікаються у вузлових точках таким чином, що досягнення одного результата можливо різними способами.
III Прості і складні програми
Прості програми включають тільки одну підпрограму або декілька ідентичних підпрограм. Кожна підпрограма позначена визначеним символом (например, А). Тоді диплоїдні одиниці розвитку містять дві ідентичні підпрограми розвитку, що дублюють один одного. Тоді проста програма може бутиь позначена двома однаковими символами (наприклад, АА). З точки зору формальної генетики, носій простої програми може бути названий гомозиготою. Складні програми включають декілька підпрограм, які позначаються подібними символами (например, А і а). В цьому випадку диплоїдні одиниці розвитку містять дві подібні підпрограми розвитку, які взаємодіють між собою різними шляхами. Тоді складна програма може бути позначена двома подібними символами (например, Аа), а носій сладної програми може бути названий гетерозиготою. Таким чином, для багатьох генів характер їх прояву чітко не визначений; фенотип організма формується в ході развитку на основі взаємодії генотипа и середовища.
Питання 2.
В онтогенетичних процесах багатоклiтинних органiзмiв активацiя генів здiйснюється не тiльки за рахунок продуктiв цитоплазми (як у одноклiтинних), але на даний процес безпосередньо впливають i сусiднi клiтини, а також гормони, якi виробляються спецiальними клiтинами.
Бiлки, якi синтезуються в результаті активації певних генів, можуть виконати рiзнi функцiї в онтогенетичних процесах:
а) здiйснювати структурнi функцiї;
б) регулювати активнiсть гeнiв;
в) регулювати темпи розмноження i мiграцiї клiтин;
г) регулювати метаболiтичнi процеси, якi вiдбуваються i за межами клітин.
У кожній диференцiйованiй клiтинi реалiзується лише частина генетичної iнформацiї, що визначає їx спецiалiзацiю i морфо-фiзiологiчнi особливості. Спецiалiзацiя клiтин є результатом синтезу визначених бiлкiв. Регуляцiя активностi генів у процесi онтогенезу полягає в тому, що у кожному типi клiтин функцiонують oкpeмi гени, якi контролюють синтез тканиноспецифiчних бiлкiв.
Доказом активацiї генів в онтогенезi є функцiональнi змiни хромосом (пуфи, хромосоми типу «лампових щiток», полiтени (гiгантськi хромосоми), а також амплiфiкацiї генів (рис.1).
Рис. 1. Функцiональнi змiни хромосом
(а – пуф; б – хромосома типу «лампових щiток»).
1. Амплiфiкацiя генів рРНК спостерiгається в ооцитах людини, земноводних, двостулкових молюскiв, комах, а також в тканинах тварин при регенерацiї, в макронуклеусi iнфузорiї i т.д. Найкраще вивчена амплiфiкацiя генів рРНК в ооцитах земноводних, де процес здiйснюється за схемою:
а) при реплiкацiї частина генів рРНК «виходить» з структури хромосом в ядерний ciк, займає положення бiля ядерної мембрани i починає автономну реплiкацiю за типом «rolling circle». Кiлькість таких генів значно перевищує кiлькiсть рРНК генів, що локалiзуються в хромосомі.
б) коли вже копiя генів рРНК досягає необхiдної кiлькостi, починається транскрипцiя, а велика кiлькiсть молекул рибосомальної РНК виходить з ядра в цитоплазму для утворення рибосом.
До амплiфiкацiї здатнi й iншi гени, якi беруть участь у процесах iндивiдуального розвитку, але на сьогоднiшнiй день вони недостатньо вивченi.
2. Хромосоми типу «ламповi щiтки» спостерiгаються в хромосомах ооцитiв земноводних, полiтенних хромосомах слинних залоз дрозофiли (та в iнших двокрилих комах), а також в ядерцевому органiзаторi. У самок земноводних (тритонiв) мейоз на деякий час припиняється на диплотеннiй стадiї, i в цей час в ооцитах йде активний синтез бiлкiв i РНК (що необхiдно для розвитку зародка). В результатi хромосоми в ооцитах подовжуються (в 100 i бiльше разiв), на них помiтнi тисячi хромомер. Вiд деяких xpoмомерів (що за всією вiрогiднiстю вiдповiдають окремим генам) вiдходять по однiй парi петель, в результатi чого хромосома набуває характерну форму «лампових щiток». Електронна мiкроскопiя таких хромосом показала, що такi петлi складаються з деспіралізованих ділянок ДНК, по всій довжині якої здійснюється транскрипція. На деспiралiзованiй молекулi ДНК розмiщенi молекули РНК-полiмерази, якi синтезують молекули iPHK.
3. У слинних залозах двокрилих зустрiчаються бiвалентнi iнтерфазнi хромосоми – гіганськi хромосоми. В таких хромосомах спостерiгаються пуфи – xapaктepнi потовщення, якi виникають внаслiдок деспiралiзації ДНК. На деспiралiзованих дiлянках ДНК йде iнтенсивний синтез iPHK, тому, вивчаючи послiдовнiсть утворення пуфiв, можна визначити, на якiй стадiї розвитку знаходиться личинка. При пересадцi ядер з клiтин слинних залоз передлялечки в клiтини раннього зародка змiнюється мicце утворення пуфiв у хромосомi, що є доказом того, що цитоплазма контролює дiяльнiсть ядра.
Часто з гаструляцією пов’язують початок роботи (експресію) генів зиготи. Існує правило, згідно до якого у видів з невеликими за розміром яйцеклітинами (200 мкм) гени починають працювати раніше, тоді як у видів з великими (0,3 мм і більше) – пізніше. Досліди у цьому напрямку ведуться із застосуванням різних методичних прийомів. Так, суть численних непрямих методів визначення експресії генів полягає в інактивації ядер зародку різними способами на певній стадії розвитку з подальшим визначенням наслідків інактивації й часу, коли вони настають. За допомогою цього, а також ряду інших подібних методів, було показано, що в риб і амфібій при опроміненні ядра зиготи розвиток зупиняється на стадії пізньої бластули, а саме з цього моменту повинні "працювати" ядра зародка. У морського їжака в аналогічних дослідах розвиток припинявся на стадії середньої бластули, у молюсків – на стадії 16-и бластомерів, у аскарид – 2-4-х бластомерів, у ссавців – після перших двох поділів дроблення.
Якщо початок роботи ядер зародку вважати початком власного розвитку, то гаструляцію, з якою пов’язують виникнення відмінностей в клітинах, а також найбільш ранню диференціацію зародка, слід розглядати в контексті експресії генів зародка.
Диференціальну активність генів в процесі гаструляції відображують поняття компетенції і детермінації. Компетентність є здатністю клітини диференціюватися в декількох небагатьох напрямках. Компетентні клітини здатні до синтезу мРНК усіх типів білків, і саме це, певною мірою, й визначає їхню можливість реалізувати певну (проте не одну) програму, тобто їхній подальший розвиток може відбуватися в певному (проте не одному) напрямку.
Детермінація - це стан, при якому клітина вже обрала певний шлях розвитку, вступила на шлях певної диференціації та знаходиться на самому його початку (між детермінацією й диференціацією немає чіткої межі). Детермінованими називають клітини, в яких відбувається диференціальна експресія генів, проте не всі синтезовані мРНК є активованими (більшість мРНК залишаються в неактивному стані). Активація ж певних мРНК і спрямовує (детермінує) напрям розвитку цих клітин. Детермінація може бути двох типів:
1. У мозаїчних яйцеклітин жорстко детерміновані ділянки цитоплазми або бластомери, які не здатні змінювати хід свого розвитку й тим самим здійснювати регуляцію (яйцеклітини членистоногих, асцидій, молюсків);
2. У регуляційних яйцеклітин детермінація визначається взаємодією клітин на пізніших стадіях розвитку (яйцеклітини ссавців, птахів, амфібій).
Диференційовані клітини – це клітини, в яких відбувається синтез специфічних білків на активних мРНК. Такий тканинноспецифічний синтез білків і зумовлює морфологічні, молекулярні й генетичні відмінності клітин різних тканин. Зауважимо, що, крім сказаного вище, важливим підсумком гаструляції в хордових є початок диференційних процесів в клітинах та формування в складі зародкових листків так званого осьового комплексу зачатків. Осьовий комплекс зачатків – це розміщені по вісі тіла зародку зачатки нервової системи (нервова пластинка) й хорди (хордальна пластинка), а також зачатки мезодерми, які лежать латерально відносно хордальної пластинки.
Отже, період гаструляції характеризується переміщенням окремих клітин, груп клітин і клітинних пластів, узгодженими змінами клітинної форми, поділами клітин, контактними взаємодіями між клітинами, виселенням і вселенням клітин, що й призводить, врешті-решт, до розшарування зародку на зародкові листки й запускає в ньому диференційні процеси. Все вищесказане свідчить про складність процесу гаструляції, багатокомпонентність, відносну незалежність і самостійність процесів, які її забезпечують. (Дзержинський БІР Частина 1. Практикум)
Питання 3.
Експресiя генів про- i eукаріот здiйснюється за рахунок спецiальних регуляторних механiзмiв. Деякi механiзми, якi працюють в бактерiальних клiтинах, вiдносно добре вивченi, але про регуляторнi механiзми еукарiотичних клiтин данi дуже обмеженi.
Генетичні програми морфогенеза утворюються двома групами генів:
1 Гени, які керуються переключенням: головні гени («Master–Genes»). До них відносять гени–регулятори, продукти яких впливають на експресію інших генів, і гомеозисні гени, які продукують морфогени – речовини, які визначають морфогенетичні процеси. До морфогенів відносять як тканиноспецифічні речовини (наприклад, гормони), так і неспецифічні низькомолекулярні сполуки (ретинова кислота).
2 Гени, що забезпечують перехід від одного стану (вузла) до іншого: виконуючі гени («Slaves–Genes»), продуктами яких є ферменти, структурні білки.
Історична довідка. Терміни головні та виконуючі гени запропонував шведський цитолог Ян-Эрік Эдстрем на початку 1960-их рр. Супер-регуляторні гени у дрозофіли відкрив швейцарський ембріолог і генетик Вальтер Герінг (початок 1990-их рр.). Термін «гомеозис» запропонував У. Бетсон в 1894 р. Під гомеозисом він розумів перетворення однієї частини організма в іншу. Гомеозисні гени у дрозофіли відкрили Эдвард Льюїс (США) и Крістіна Нюссляйн-Вольхардт і Эрік Вішхаус (Германія) (Нобелівська премія).
Експресія всіх генів контролюється різноманітними ефекторами. Частина з них закодована в генотипі, частина – поступає в клітини зовні або утворюється під час метаболічних реакцій. Синтез ефекторів контролюється умовами зовнішнього середовища, наприклад, білки «теплового шоку», що регулюють процеси транскрипції, синтезуються у дрозофіли при температурі више 35 °С, при дії антибіотика антиміцина А, гідроксиламіна, колхіцина, хлорида аммонія та інших речовин.
Регуляція експресії всіх генів проходить на різних рівнях:
1. Регуляція на генному рівні проходить різними шляхами
1.1. Модифікація ДНК (наприклад, заміна цитозина або гуаніна на метил-цитозин або метил-гуанін; метилювання основ знижує активність генів).
1.2. Збільшення об'єму ДНК в клітині шляхом диференціальної ампліфікації ДНК (наприклад, багаторазове копіювання генів рРНК) або за рахунок утворення політенних хромосом.
1.3. Програмовані кількісні зміни ДНК (наприклад, зміни орієнтації промотора).
1.4. Сплайсинг ДНК (наприклад, вирізання частин генів, що кодують антитіла).
1.5. Дімінуція хроматина – незворотня втрата частини генетичного матеріалу в соматичних клітинах деяких організмів (інфузорій, аскарид, циклопів).
1.6. Зміна активності цілих хромосом (наприклад, інактивація однієї з двох X–хромосом у самок ссавців).
1.7. Зміни послідовностей ДНК за допомогою рухомих генетичних елементів, наприклад, транспозонів.
2. Регуляція на рівні транскрипції – шляхом регуляції транскрипції мРНК. Інтенсивне функціонування окремих генів або їх блоків відповідає визначеним етапам розвитку і диференціювання. Регуляторами транскрипції у тварин часто є стероїдні гормони.
3. Регуляція на рівні сплайсинга (посттранскрипційної модифікації мРНК) – забезпечує можливість утворення різних типів зрілої, функціонально активної мРНК. Процессинг РНК регулюється за допомогою рибозимів (каталізаторів рибонуклеїнової природи) і ферментів матураз. Деякі генетичні захворювання людини (фенілкетонурія, деякі гемоглобінопатії) обумовлені порушенням сплайсинга.
4. Регуляція на рівні трансляції – обумовлена різною активністю різних типів мРНК.
5. Регуляція на рівні посттрансляційної модификації білків – регулюється шляхом посттрансляційної модификації білків (фосфорилюванням, ацетилюванням, розщепленням вихідного поліпептидного ланцюга на більш мілкі фрагменти і т.д.).
Розглянуті приклади свідчать про різноманітність способів реалізації генетичної інформації щляхом регуляції активності самих генів або їх продуктів. Проте слід відмітити, що для клітини найбільш економною є регуляція на рівні транскрипції, оскільки вона перешкоджає утворенню відповідних мРНК і білків, коли клітина їх не потребує. Разом з тим регуляція на рівні транскрипції йде повільно, тоді як, наприклад, активація білків шляхом розщеплення молекул-попередників хоч і неекономне, але проходить дуже швидко.
Ще в 1961 р. Жакоб i Моно проводили експеримент по вивченню індукції синтезу ферментiв. Вiдомо, що в бактерiальнiй клітинi ферменти синтезуються лише при наявностi метаболiту (субстрату), який даний фермент розщеплює або «прилаштовує» в потрiбне мiсце в комплексi бiохiмiчних реакцiй. При вiдсутностi субстрату фермент не синтезується, тому вченi допускали iснування спецiальної речовини, здатної регулювати процеси синтезу ферментів.
При введеннi в середовище, на якому культивували бактерiальнi клiтини лактози (субстрат), концентрацiя β-галактозидази (ферменту, розщеплюючого лактозу) збiльшилася у 100 разiв, тобто субстратом була активiзована (індукована) транскрипцiя. Паралельно з лактозою iндукувався синтез й iнших бiлкiв: галактозидпермеази (бiлок, здiйснюючий транспорт лактози через мембрану) i тiогалактозидацетилтрансферази. Три структурнi гени, що кодують данi ферменти (ген Z, Y, А), разом з операторною дiлянкою ДНК утворюють lас-оперон бактерiального геному. Активнiсть транскрипцiї генів оперону контролюється четвертим, регуляторним геном (ген І), що локалiзується безпосередньо бiля структурних генів. Іcнування регуляторного гена І було доведено на мутантних штамах. Виявилося, що при вiдсутностi регуляторного гена І (І¯ бактерiї) в бактерiальнiй клiтинi постiйно пiдтримується експресiя генів Z, Y i А - навіть без присутностi лактози. При введеннi фрагментiв ДНК з регуляторним геном І в мутантнi клiтини - транскрипцiя i синтез знову стали контролюватися в результатi того, що експресiя структурних генів вiдбулася лише при наявностi лактози.
Тому вченi зробили висновок, що ген І кодує спецiальну речовину (репресор), яка здатна регулювати процес транскрипцiї структyрних генiв.Репресор - це бiлок, який блокує транскрипцiю (рис. 2).
Рис. 2. Будова та експресiя lac – оперону.
В системi lac-oпepoнy lас-репресор icнyє у виглядi тетрамерного бiлка, який зв’язується спеціальною ділянкою ДНК-оператором. Оператор локалiзується безпосередньо бiля першого структурного гена. Операторна послiдовність, з якою зв'язується репресор, включає дiлянку полiндромної ДНК, з визначеною послiдовнiстю нуклеотидiв i симетрiєю 2-го порядку:
5'_ААТТГТ_ _ _ _АЦААТТ_3'
3'_ТТААЦА_ _ _ _ТГТТАА_5'
Перед операторами в молекулi ДНК знаходиться спецiальна дiлянка промотор. Промотор зв’язує РНК-полiмеразу при транскрипцiї. Оскiльки оператор (мiсце зв’язування репресора) i промотор частково перекриваються, РНК-полімераза не може зв’язуватися з промотором при наявності на молекулі ДНК-репресора. В такому випадку репресія блокована.
Лактоза, яка виконує функцію індуктора в системі lac-оперону, зв’язується з репресором, перетворює його в неактивну форму, в результаті чого останній відокремлюється від lac-оператора. Такий тип індукції, коли транскрипція починається після віддалення репресора, називається негативною регуляцією.
Негативна регуляцiя здiйснюється i при катаболiтичнiй репресiї. При репресiї репресор зв’язується з оператором в комплексi з низькомолекулярним кофактором (корепресором). Корепресором може бути кiнцевий продукт бiосинтезу бiлка, що кодується опероном. Досягаючи певної концентрацiї, цей продукт зв'язується з репресором i припиняє транскрипцiю. За такою схемою здiйснюється регуляцiя транскрипцiї триптофанного оперону. Trp-оперон складається з оператора та структурних генів A-B-C-D-E. Гени кодують ферменти, якi беруть участь у синтезi триптофану. Коли концентрацiя продукту досягає певного рiвня, то триптофан зв'язується з димерним trp-репресором, що кодується окремим (не вмiщеним в оперон) регуляторним геном. В результатi конформацiйних змiн вiдкривається дiлянка, яка здатна зв’язуватися з операторною послiдовнicтю ДНК. Далi комплекс зв'язується з молекулою ДНК i блокує мicце з'єднання РНК-полiмерази- промотор.
Для trp-оперону характерною є i друга система регуляцiї, що зв’язана з наявнiстю аттенуатора. Нуклеотидна послiдовнiсть аттенуатора, що мicтиться безпосередньо перед першим структурним геном, включає команду, яка здiйсиює завчасну термiнацiю транскрипцiї.
На вiдмiну вiд негативної регуляцiї позитивна регуляцiя характеризується тим, що транскрипцiя включається при приєднаннi регуляторного бiлка до оперону. Для iндукцiї транскрипцiї необхiдно, щоб коактиватор приєднався до бiлка-активатора i утворений комплекс зв’язувався вiдповiдальною дiлянкою ДНК.
Як вже було вiдмiчено, багатоклiтиннi еукарiотичнi органiзми характеризуються спецiалiзацiєю клiтин i тканин i незалежно вiд того, що в клiтинах мiститься однакова генетична програма (ДНК), в рiзних тканинах вiдбувається експресiя рiзних генів. Для того, щоб визначити, якi гени мають функцiонувати на даному етапi розвитку, icнують механiзми на рiзних рiвнях матричного синтезу: на piвнi транскрипцiї i трансляцiї - посттранскрипцiйна i посттрансляцiйна регуляцiя, а також регуляцiя за допомогою гормонів:
а) регуляцiя на piвнi транскрипцiї здiйснюється при синтезi iPHK Кiлькiсть копiй iРНК рiзних генів значно вiдрiзняється, що пояснюється тим, що копiї iPHK одних генів скорiше руйнуються вiд iнших, неоднакова також швидкicть синтезу iPHK рiзних генів. Регуляцiя здiйснюється за допомогою бiлкiв, здатних зв'язувати ДНК, а також за допомогою коротких фрагментiв РНК, які, зв’язуючись з молекулою ДНК, блокують місце прикріплення РНК-полімерази. В результаті швидкість транскрипції прискорюється або сповільнюється.
б) посттранскрипційна регуляція здійснюється на рівні процесингу іРНК.
Процесинг – це процес формування молекул РНК з попередника, що вiдбувається на стадiї мiж транскрипцiєю i трансляцією (рис. 3). Процесинг, який здiйснює модифiкацiю 5' - i 3' - кiнцiв, а також сплайсинг екзонiв, вiдбувається по-рiзному в рiзних молекул iPHK;
Рис. 3. Схема сплайсингу (за Даншеном та Сломiнськi).
в) на piвнi трансляцiї регуляцiя здiйснюється за рахунок того, що виключається можливicть використання iPHK як матрицi для синтезу бiлка. В ооцитах деяких тварин (морського їжака) синтез бiлка починається пiсля заплiднення яйцеклiтини, незалежно вiд того, що цитоплазма мiстить багато молекул iPHK;
г) у зв'язку з тим, що бiлки синтезуються в неактивнiй формi i повиннi пройти стадiю модифiкацiї, icнyє система посттрансляцiйної регуляцiї. Наприклад, в β-клiтинах пiдшлункової залози синтезується попередник iнсулiну - довгий полiпептидний ланцюг з додатковою послiдовнiстю амiнокислотних залишкiв, що в подальшому вирiзується протеолiтичним ферментом. Таким чином, синтез активного гормону регулюється посттрансляцiйною системою - за допомогою регуляцiї активностi протеолiтичного ферменту;
д) регуляцiя за допомогою гормонів частково здiйснюється на piвнi транскрипцiї. Таким чином, органiзм -активiзує деякi гени у вiдповiдь на зовнiшнi сигнали. Стероїднi гормони, якi синтезуються в одних клiтинах за допомогою спецiальних транспортних бiлкiв, потрапляють в «клiтини-мiшенi», де вони активують певнi гени шляхом безпосередньої дiї на хроматин у визначених мicцях. Кожний гормон активує специфiчний набiр генів, тому i гормони вибiрково дiють на клiтини органiзму.