senchuk_v_v_biohimiya_kurs_lekcii

ÐÍÏ, как правило, локализованы в цитозоле и в ядре клеток. Представляют собой сложный комплекс различных белков и РНК. РНК-содержащие вирусы также можно отнести в РНП.

Нуклеопротеины построены гораздо сложнее других гетеромерных белков и вполне справедливо могут быть отнесены к надмолекулярным комплексам. Наряду с традиционными методами из биохимии белков и нуклеиновых кислот для изучения нуклеопротеинов применяют особые приемы. Одним из них является футпринтинг, который включает формирование комплекса между белком и ДНК, а затем обработку этого комплекса нуклеазами (рестриктазами). При этом происходит разрезание только свободных участков ДНК и их удаление из комплекса, так как белок закрывает от расщепления только тот участок ДНК, с которым он связывается. В результате можно получить комплекс (белок—участок ДНК), а структуру этого участка ДНК можно определить секвенированием. Аналогичный экспериментальный подход используется для установления структуры ДНК-связывающих участков в белках. В этом случае разрезается не ДНК, а белок с помощью протеолитических ферментов, и следовательно, в комплексе с ДНК удерживается только ДНК-свя- зывающий участок или домен белка. Комплексообразование белков и нуклеиновых кислот легко детектируется методом электрофореза. Для этого интересующий белок или группу белков смешивают с ДНК и через некоторое время после возможного образования комплекса подвергают электрофоретическому разделению. Поскольку молекулярная масса белков намного меньше, чем у ДНК, то только связанный с ДНК белок исчезнет из своего обычного расположения на электрофореграмме и переместится на место расположения ДНК в геле (так называемый øèôò-àíà- ëèç, т. е. анализ сдвига).

Липопротеины

Липопротеины относятся к сложным гидрофобным белкам, которые представляют собой нековалентные комплексы с фосфолипидами, холестерином и его эфирами, ацилглицеринами, свободными жирными кислотами.

Изредка встречаются ковалентные соединения. Так, некоторые белки плазматической мембраны подвергаются обратимому миристилированию, т. е. присоединению миристиновой жирной кислоты. В результате на поверхности белковой молекулы появ-

62

ляется «якорь», который служит для прикрепления белка к мембране.

Все липопротеины делят на две группы:

свободные липопротеины — циркулируют в кровяном

русле;

связанные (структурные) липопротеины мембран хлоропластов, плазматических мембран, в особенности миелиновых, а также фоторецепторных мембран.

Липопротеины крови — довольно крупные мицеллярные частицы с диаметром до 70 нм, устроены они нерегулярно, содержат фосфолипиды, холестерин и его эфиры, свободные жирные кислоты. Белковая часть представлена аполипопротеинами. В зависимости от плотности липопротеины делят на четыре типа:

липопротеины высокой плотности — содержат до 50 % белка, до 30 % фосфолипидов, около 20 % холестерина;

липопротеины низкой плотности — содержат до 50 % холестерина;

липопротеины очень низкой плотности;

хиломикроны — содержат до 95 % триацилглицеринов. Плотность увеличивается, а размеры уменьшаются с увели-

чением содержания белка. Различные липопротеины получают из крови методом ультрацентрифугирования. Все липопротеины специализированы для транспорта липидов по организму. Липопротеины имеют специальные рецепторы на клетках-мише- нях. После связывания липопротеина с рецептором запускается процесс его проникновения в клетку. При недостаточной активности компонентов антиоксидантной системы организма или под действием повреждающих физико-химических факторов внешней среды может происходить активация реакций перекисного окисления холестерина и ненасыщенных жирных кислот липопротеинов. В результате появляются продукты окисления, которые играют пусковую роль в сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваниях.

Металлопротеины

Металлопротеины — это соединения белков с металлами, которые чрезвычайно широко распространены в живых объектах. Изредка встречаются и металлопептиды. По сути дела, выяснение механизмов функционирования металлопротеинов отве- чает на вопрос, что делают неорганические соединения в живых системах. Металлопротеины — это плод взаимодействия неорга-

63

нических и органических соединений. Существуют координационные, ионные или ковалентные соединения белковых молекул с ионами металлов, оксидами металлов, неорганическими полимерами и даже с металлоорганическими соединениями. В состав металлопротеинов входят Fe, Zn, Mn, Mo, Cu, Mg, K, Na, Ca, Se, Co, Ni, V, часто в различных степенях окисления. Изменение степени окисления металла обычно является ключевой стадией в биохимической работе металлопротеинов и металлоферментов. Несмотря на то, что многие неорганические соединения этих металлов весьма токсичны, нетоксичные формы металлов должны поступать в любые клетки для обеспечения нормальной жизнедеятельности. Гемопротеины, кобамидные белки с известными оговорками также можно отнести к металлопротеинам. К металлопротеинам можно также отнести и белки, активируемые металлами, так как они способны образовывать временные комплексы с металлами. Металлы могут входить в состав активных центров, участвовать в катализе, поддерживать нативную конформацию белков. Ионы металлов обычно координируются с определенными лигандами, т. е. с функциональными группами остатков аминокислот в белках. Например, ионы Fe, Zn, Mn, Mo, Cu, Со образуют прочные комплексы с азотом гистидина, с серой цистеина и метионина. Ионы Mg связываются с анионами остатков фосфорной кислоты и дикарбоновых кислот, а Са — с -кар- боксильным производным остатка глутаминовой кислоты.

Транспортная функция металлопротеинов. Например, белок сыворотки крови трансферрин транспортирует Fe по организму. В трансферрине железо координировано с кислородом остатка тирозина и на долю Fe в составе белка приходится 0,13 %.

Запасная функция металлопротеинов хорошо иллюстрируется белком ферритином, который имеет молекулярную массу около 400 000, содержит до 40 % железа в виде неорганического полимерного соединения и осуществляет депонирование железа в селезенке и в костном мозге организма.

Электрон-транспортная и многочисленные ферментативные функции также реализуются металлопротеинами.

Металлопротеины участвуют в защите клеток и организма от токсичных металлов. Эту функцию выполняют белки металлотионеины, которые связывают ионы тяжелых металлов (Hg, Cd, Cr и др.) и предотвращают их неблагоприятное действие. Металлотионеины локализованы во многих типах клеток организма, и их синтез резко активируется при поступлении в организм тяжелых металлов.

64

Очень важную группу металлопротеинов составляют селенопротеины:

глутатионпероксидаза — фермент антиокислительной системы, который осуществляет связывание токсичных соединений

ñглутатионом и, следовательно, их детоксикацию;

фермент 5’-дейодиназа участвует в действии тиреоидных гормонов, превращая в клетках-мишенях малоактивный L-ти- роксин в активный L-3,3’,5-трийодтиронин.

При избыточном поступлении селен способен заменять серу в метионине и таким образом неспецифически включаться в различные белки.

Структура некоторых белков достигает просто удивительной сложности, когда в третичной структуре формируются центры связывания одновременно для нескольких коферментов, кофакторов или простетических групп. Пожалуй, среди известных в настоящее время белков самым сложным строением обладает NO-синтаза, которая осуществляет в клетках реакцию N-окисле- ния L-аргинина по гуанидиновой группе с образованием универсального регулятора биохимических реакций — монооксида азота (NO). Этот фермент сочетает в одной полипептидной цепи редуктазную и оксигеназную активности, используя в качестве ко-

факторов сразу НАДФН, ФМН, ФАД, тетрагидробиоптерин и гем при регуляторном участии комплекса Са2+-кальмодулин. Таким образом, NO-синтетаза представляет собой уникальный пример полифункциональной биохимической машины, сочетающей на основе единственной полипептидной цепи 5 коферментов!

Химерные белки — особый тип сложных и необычных белков, которые в основном являются продуктами биоинженерии — белковой инженерии è генетической инженерии. Методы белковой инженерии позволяют сшивать различные белки с помощью специфических бифункциональных реагентов в единый ковалентный комплекс. Генноинженерные технологии дают возможность конструировать химерные белки, манипулируя генами различных белков, т. е. в конечном итоге можно получать генетически кодируемые новые белки, части которых построены из различных полипептидных цепей. Целью таких работ является создание искусственных, т. е. не существующих в природе, более активных и стабильных белков, в том числе ферментов. Однако, несмотря на определенные успехи в конструировании химерных белков в настоящее время, следует признать, что результаты «эволюции» белков в биохимических лабораториях пока несрав-

65

нимы с достижениями многих миллионов лет белковой эволюции в природе.

Простетические группы, коферменты, кофакторы сложных белков не кодируются генетически и не синтезируются рибосомами в реакциях трансляции, а очень точно и воспроизводимо встраиваются в структуру готовых белков с помощью специальных белков и ферментов. Независимо от способа связи небелковой части в нативном полипептиде во взаимодействие вступают только определенные функциональные группы аминокислотных радикалов. Поскольку эффективное связывание небелковых кофакторов реализуется только на уровне третичной структуры белков, аминокислоты связывающего центра расположены в различных местах первичной структуры. Параллельно с трансляцией (котрансляционно) и/или после завершения трансляции (посттрансляционно) идет формирование нативной структуры белка, т. е. осуществляется процесс фолдинга. Считается, что это во многом самопроизвольный процесс, который эффективно протекает при специфических для каждого белка условиях среды (рН, ионная сила, наличие кофакторов) и при непосредственном участии особых белков. Эти специфические белки, шапероны, играют роль своеобразной матрицы, на которой происходит сборка пространственных белковых структур. Фолдинг до сих пор является одним из наиболее таинственных общебиологических явлений. Дело в том, что вероятное число теоретически возможных конформаций любого белка столь велико, что длительность простого перебора таких структур до достижения нативной конформации на десятки порядков превышает оцениваемое время существования Вселенной. Тем самым фолдинг белка — событие невероятное, которое, однако, с удивительной легкостью происходит в клетках! Не менее загадочна сборка субъединичных белков, полипептидные цепи которых кодируются разными генами в разных хромосомах, но с удивительным постоянством и точностью находят друг друга в клетке! Вместе с тем не менее 100 типов биохимической посттрансляционной модификации боковых групп аминокислот вносят существенный вклад в формирование вторичной, третичной и четвертичной структуры белка, в процесс направленного транспорта белков, в регулирование их активности и времени жизни. Сюда относятся ковалентные, функционально обратимые реакции гликозилирования, фосфорилирования серина, треонина и тирозина, метилирования гистидина и лизина, ацетилирования по N-концу, аденилирования

66

тирозина, амидирования по свободным СООН-группам и др. Есть также ковалентные функционально необратимые реакции: например, превращение пролина в оксипролин и лизина в гидроксилизин, циклизация глутаминовой кислоты с образованием пироглутамата. Все посттрансляционные реакции аминокислотных остатков белков идут с участием специфических ферментов. Особый способ посттрансляционных модификаций ведет к появ-

Ðèñ. 11. Карбоксилирование остатков L-Глу (участки карбоксилирования показаны стрелками)

лению хелатных центров для ионов Ca в некоторых белках. Такие центры образуются в результате витамин К-зависимой ферментативной реакции присоединения карбоксильной группы к остаткам дикарбоновых аминокислот в составе белков, например в реакции карбоксилирования глутаминовой кислоты (рис. 11). Образующиеся хелатные центры очень специфичны для ионов Ca (например, не связывают Mg2+) и связывают Ca2+ с высоким сродством, т. е. при концентрациях Ca2+ < 10 –6 Ì. Ca2+-связыва- ющие белки относятся к регуляторам биохимических реакций. Так, например, кальмодулин — это универсальный внутриклеточный Ca2+-зависимый регулятор реакций фосфорилирования белков, а тропонин С — Ca2+-зависимый регулятор сокращения мышечных белков.

Ограниченный протеолиз также относится к важнейшим посттрансляционным модификациям белков и осуществляется специфическими протеолитическими ферментами, которые распознают строго определенные олигопептидные участки в атакуемом белке. Вполне очевидно, что участки протеолиза с высокой степенью вероятности локализованы в междоменных и в поверхностных участках белков. Ограниченный протеолиз — это очень точный и воспроизводимый процесс. В результате образуется набор двух и более полипептидов и/или пептидов, большинство из которых обычно уничтожается протеазами. Лишь избранные

67

белково-пептидные продукты ограниченного протеолиза представляют собой активные биомолекулы.

Ограниченный протеолиз участвует в регуляции направленного внутриклеточного транспорта белков, что достигается путем отщепления в N-концевой части белков сигнального пептида. Этот обычно гидрофобный пептид состоит из 16 — 20 аминокислот. Сигнальный пептид помогает прохождению синтезируемого белка через мембрану эндоплазматической сети, митохондрий и хлоропластов. Он отщепляется в полости эндоплазмати- ческой сети в случае секретируемых белков. Сигнальные пептиды есть не только у белков, синтезируемых в цитоплазме, но и у многих белков, автономно синтезируемых в митохондриях и хлоропластах.

Ограниченный протеолиз широко применяется в биологи- ческих системах как способ активации неактивных более крупных белков-предшественников путем поэтапного отщепления определенных участков полипептидной цепи. Активация ограниченным протеолизом характерна для многих протеолитиче- ских ферментов, включая гидролитические ферменты пищеварительного сока поджелудочной железы. Подобным образом непосредственно в крови неактивный декапептид ангиотензин I гидролизуется специфической пептидазой по С-концу с образованием активного октапептида ангиотензина II, который стимулирует выброс в кровь альдостерона, вызывает сужение сосудов и повышение давления крови. Многоэтапный процесс ограниченного протеолиза служит в качестве универсального механизма активации большинства белково-пептидных гормонов. Так синтезируется, например, гастрин — гормон желудоч- но-кишечного тракта, который используется для стимуляции секреции желудком Н+, Cl– и пепсина. В реакциях ограниченного протеолиза по С-концевой части неактивного прогастрина (101 аминокислота) образуются две изоформы активного гастрина (34 аминокислоты и 17 аминокислот). Таким образом, цена активации гастрина составляет 67 и 84 аминокислоты, которые кодируются генетически, но не используются для выполнения гормональной функции! К этому можно добавить, что ген гастрина состоит из 4097 пар оснований, из которых экзоны, т. е. кодирующая часть, составляют всего лишь 303 пары оснований — около 7 % всего гена! Этот пример хорошо иллюстрирует, насколько дорогостоящим является биосинтез пептидного гормона.

68

НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды) относятся к важнейшим и универсальным биомолекулам всех биологических объектов — от вирусов до человека. Все природные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты построены по единому плану. Обязательной составной частью этих соединений являются азотистые основания. По существу, именно особенности химической структуры азотистых оснований лежат в основе таких фундаментальных биологических процессов, как, например, хранение, воспроизведение и передача генетической информации.

АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ

Строение, классификация и номенклатура азотистых оснований

Азотистые основания — это оснувные ароматические соединения, производные двух гетероциклических структур — пурина и пиримидина. Пурин представляет собой конъюгат двух гетероциклов — пиримидина и имидазола. По химическим свойствам азотсодержащие пиримидиновый и пуриновый циклы относятся к высокостабильным соединениям, а электронодонорные и/или электроноакцепторные заместители лишь незначи- тельно активируют эти структуры. Считается, что биохимиче- ская стабильность азотистых оснований существенно определила эволюционный выбор пуриновых и пиримидиновых оснований для хранения и воспроизведения генетической информации. Заместители (=О, -ОН, -NH2) в гетероциклах обеспечивают разнообразие химической структуры азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, возможность эффективно образовывать межмолекулярные водородные связи, которые обеспечивают фундаментальный принцип живого — комплементарность. Расположение атомов гидрофобных ядер азотистых оснований копланарно (в одной плоскости), что очень важно для формирования

70

особой вторичной структуры нуклеиновых кислот в виде двойной спирали. Основн е (или канонические) азотистые основания входят в состав нуклеиновых кислот и делятся:

на пуриновые — аденин и гуанин;

пиримидиновые — тимин, цитозин, урацил.

Âсостав ДНК входят аденин, гуанин, тимин и цитозин, а в состав РНК — аденин, гуанин, цитозин и урацил (вместо тимина). В нуклеиновых кислотах встречаются и так называемые минорные азотистые основания — главным образом метилированные производные основных азотистых оснований.

Правила нумерации атомов и названия азотистых оснований по ИЮПАК показаны на рис. 12 и рис. 13. В клетках и во внеклеточной среде концентрация свободных азотистых оснований обычно невелика, значительно меньше, чем концентрация многочисленных и разнообразных производных азотистых оснований.

К важнейшим свободным азотистым основаниям относятся: продукт метаболизма пуринов мочевая кислота (2,6,8-триоксо- пурин), психостимулятор кофеин (1,3,7-триметил-2,6-диоксопу-

Ðèñ. 12. Пуриновые азотистые основания

Ðèñ. 13. Пиримидиновые азотистые соединения

71