biophysika_konspekt2

колебательный уровень, с которого осуществляется переход в 8^. Поэтому константу ктз можно представить в виде

АЕ где А — константа; АЕ — энергия активации перехода на более высокий

колебательный уровень триплетного состояния.

Если учесть, что &фс = 1/т0 фс, где т0 фс — излучательное время жизни триплетов в отсутствие процессов тушения (например, в твердой матрице при

Ф^-ЧфсФфИ' КТ- Действительно, определенные по спектрам (см. рис. 2.29) величины 1п

(Фзфл/ффс) линейно зависят от обратной температуры (рис. 2.29). Полученное из наклона графика значение АЕ совпадает с энергетической разностью между максимумами двух полос испускания, тем самым подтверждая наличие предполагаемого механизма.

Интенсивность замедленной флуоресценции, равно как и фосфоресценции при комнатных температурах, исключительно низка из-за тушения долгоживущих триплетных состояний молекулами кислорода. Удаление кислорода, так же как и увеличение вязкости среды, усиливает замедленную флуоресценцию и фосфоресценцию. Например, в спектре испускания металлопорфиринов, входящих в состав мембран микроорганизмов, в отсутствие кислорода наблюдается замедленная флуоресценция с максимумами при 590 и 630 нм и фосфоресценция с максимумами при 720 и 800 нм. С увеличением концентрации кислорода в среде свечение тушится.

2.29. Зависимость замедленной флуоресценции эозина в этаноле от температуры

2.18.Фосфоресценция при физиологических температурах

В жидких растворах при положительных температурах фосфоресценцию веществ трудно обнаружить из-за ее крайне низкой интенсивности. Это связано прежде всего с тем, что квантовый выход фосфоресценции при данных условиях на много порядков ниже квантового выхода флуоресценции. Дело в том, что вероятность безызлучательного перехода в молекуле, а следовательно

— вероятность тушения люминесценции, пропорциональна времени жизни возбужденного состояния, которое для триплетных состояний на несколько порядков выше, чем для синглетных. Используя чувствительные фосфороскопы, способные к тому же измерять фосфоресценцию с малым временем затухания, удается все же измерить фосфоресценцию таких объектов, как триптофан, тирозин и белки. При этом время затухания оказалось чувствительным показателем молекулярной подвижности полипептидных цепей белков, поскольку с увеличением подвижности усиливаются процессы тушения триплетных состояний и сокращается время затухания

42

фосфоресценции (тл ). На рис. 2.30 показана зависимость тфс индольной группы триптофана от вязкости среды, а в табл. 2.2 приведены времена затухания фосфоресценции некоторых белков.

Рис. 2.30. Зависимость времени жизни триплетного состояния индольного кольца триптофана от микровязкости среды. Измерения проводили в фосфатном буфере, содержащем различные концентрации пропиленгликоля [по: Д. Б. Страмбини, М. Гоннелли, 1985]

Хорошо видно, что время жизни уменьшается при снижении микровязкости среды. При комнатной температуре время затухания фосфоресценции и, следовательно, микровязкость окружения триптофановых остатков заметно различается в разных белках, но всегда снижается с ростом температуры. Сравнение времени затухания фосфоресценции (от 50 мкс до 3 с у разных белков) с зависимостью времени затухания от микровязкости позволило установить, что различия микровязкости внутри белков очень велики (от 0,1 до 106 Па • с). При изменениях конформации белковых молекул в результате связывания субстратов, ингибиторов и других регуляторов ферментной активности наблюдаются изменения времени затухания фосфоресценции.

В целых живых клетках и тканях параметры фосфоресценции при физиологических температурах определяются как изменениями микровязкости окружения триптофановых остатков (А), так и изменением концентрации кислорода в клетке. Дело в том, что невозбужденные молекулы молекулярного кислорода находятся в триплетном состоянии и активно тушат триплетное состояние других молекул при столкновении с ними:

3А » А + /гу (фосфоресценция)

3А + 302 > А + 102 (тушение фосфоресценции)

Основной вклад в фосфоресценцию живых клеток и тканей вносят белки, входящие в состав биологических мембран, внутри которых процессы тушения затруднены (С. В. Конев, В. М. Мажуль и др., 1983). Изменения параметров фосфоресценции могут, как мы видели, быть весьма чувствительными индикаторами изменений состояния белковых молекул и их окружения в клетке.

Таблица 2.2 Время жизни фосфоресценции белков (в секундах) в буферном растворе

при различных температурах [по: М. Гоннелли, Д. Б. Страмбини, 1993]

1 РНК-аза — рибонуклеаза Т4 (фосфоресцирует тирозин); 2 ЛДГ — лактат-

43

дегидрогеназа (фосфоресцирует триптофан);3 ЩФ — щелочная фосфатаза (фосфоресцирует триптофан).

2.9. Перенос энергии электронного возбуждения. Явление переноса энергии,

В 1941 г. А. Сент-Дьердьи, а затем в 1948 г. Н. Риль выдвинули предположение о возможности передачи энергии электронного возбуждения в пределах белковой молекулы. Согласно их гипотезе, белковая молекула обладает свойствами полупроводникового кристаллофосфора: квант света, поглощенный белком, вызывает электронный переход на обобщенный электронный уровень (в зону проводимости), по которому электрон может переноситься в пределах всей макромолекулы; затем энергия возбуждения может затрачиваться на излучение фотона (люминесценция) или фотохимическую реакцию в определенном участке белка. На основании собственного экспериментального материала и анализа литературы Ю. А. Владимиров и С. В. Конев (1958) пришли к иному выводу: перенос энергии электронного возбуждения между отдельными группами белковой молекулы возможен, но он связан не с полупроводниковыми свойствами белка, а с явлением индуктивно-резонансного переноса (миграции) энергии между хромофорами по механизму, предложенному ранее для физических систем С. И. Вавиловым и Т. Фѐрстером. В дальнейшем перенос энергии между донорной и акцепторной группами в белках и мембранах широко использовался при изучении пространственной структуры этих объектов.

Перенос энергии электронного возбуждения между двумя молекулами можно представить в следующем виде:

Б* + А >Б + А*

В результате переноса энергии возбужденная молекула донора энергии Б* переходит в основное (невозбужденное) состояние Б, а молекула акцептора энергии переходит из невозбужденного состояния А в возбужденное А*. Следует отметить, что донором и акцептором энергии не обязательно являются молекулы разных веществ, ими могут быть также и разные молекулы одного и того же вещества:

А* + А> А + А* Перенос энергии между одинаковыми молекулами (который может быть

многократным) называют миграцией энергии. Один из возможных способов переноса энергии между молекулами донора и акцептора заключается в том, что молекула Б* излучает квант флуоресценции, а молекула А его поглощает:

Б*---------------------->Б + Бфл0; Бфл1 + А >А*

Такой перенос за счет реабсорбции света флуоресценции называют излучательным. При достаточно малых расстояниях между молекулами донора и акцептора перенос становится безызлучательным.

Безызлучательный перенос энергии может происходить в момент тесного контакта молекул при их кинетических соударениях, происходящих вследствие диффузии1. Однако, если полностью исключить возможность такого зависящего от диффузии взаимодействия молекул, например, при изучении

44

процессов, происходящих в очень вязких растворах или в стекловидной матрице, то в некоторых случаях перенос энергии возбуждения тем не менее будет происходить с высокой эффективностью.

Рассмотрим явления, относящиеся к диффузионно-независимому переносу энергии.

Термин «диффузия» в данном случае по сложившейся традиции означает тепловое движение молекул в растворе.

Методы изучения процесса переноса энергии между разными молекулами и миграции энергии между одинаковыми молекулами в растворах различны. С. И. Вавиловым для изучения миграции энергии между одинаковыми молекулами был предложен метод измерения поляризации флуоресценции. В вязких растворах степень поляризации Р равна предельному значению Р0. Но самое высокое значение степень поляризации принимает в очень разбавленных растворах, где расстояния между молекулами велики. По мере уменьшения расстояния между молекулами начинается миграция энергии возбуждения. Теоретические расчеты показывают, что даже однократный перерос энергии между случайно ориентированными молекулами образца приводит к практически полной деполяризации флуоресценции.

Для изучения переноса энергии между разными молекулами используют несколько методов, применяемых порознь или в сочетании.

1.Измеряют снижение квантового выхода флуоресценции донора в присутствии акцептора энергии. От динамического тушения по механизму Штерна—Фольмера это явление отличается тем, что не зависит от вязкости среды.

2.Измеряют сенсибилизированную донором флуоресценцию акцептора энергии. Явление сенсибилизированной люминесценции заключается в том, что под действием излучения, поглощаемого в основном молекулами донора, происходит излучение квантов флуоресценции молекулами акцептора энергии:

-» Б* Поглощение света донором

■> Б + ЬУфпЕ) Флуоресценция донора >П Внутримолекулярное безызлучательное тушение донора

В* + А > В + А* Перенос энергии кфлА > А + ЙУф„А Люминесценция акцептора

где: кфл0, кбв, кп(К), кфлА — константы скорости перечисленных процессов. Константа скорости переноса энергии кП(К) зависит от расстояния К между молекулами донора и акцептора.

3.Измеряют сенсибилизированную фотохимическую реакцию: действующее излучение поглощается в основном молекулами донора энергии, а молекулы акцептора вступают в фотохимический процесс.

4.Для обнаружения переноса измеряют сокращение времени затухания флуоресценции донора (хс) в присутствии акцептора, а также увеличение хА при возбуждении в полосе поглощения донора, так как при переносе от Б* к А время хА включает в себя суммарное время жизни молекул донора до момента

45

переноса энергии и время жизни возбужденного состояния акцептора энергии.

3.2.Теория индуктивно-резонансного переноса энергии

Теория переноса энергии электронного возбуждения между молекулами в конце 40-х — начале 50-х гг. XX в. была развита в работах С. И. Вавилова, М. Д. Галанина и Т. Фѐрстера на основании изучения деполяризации флуоресценции растворов и_сенсебилизированной флуоресценции.| Согласно этои теории, между донором О* и акцептором энергии А происходит электростатическое взаимодействие по типу диполь — индуцированный диполь. Для осуществления переноса энергии необходимо выполнение условия резонанса: разность энергий основного и возбужденного электронных уровней обеих молекул должна быть одинакова (совпадение собственных частот осцилляторов) и условия индукции — взаимодействие между молекулами должно быть достаточно сильным. Для соблюдения этих условий необходимо выполнение нескольких правил.

1.Донор энергии должен обладать способностью к люминесценции. В отсутствие акцептора вероятность излучательного перехода в возбужденной

молекуле донора равна квантовому выходу люминесценции донора ффл0. Время жизни молекулы донора в возбужденном состоянии т = х0 • ффл0, где х0 — естественное время жизни в отсутствие каких-либо процессов тушения в возбужденной молекуле. С другой стороны, понятно, что вероятность переноса энергии увеличивается при большем х. Таким образом, чем выше квантовый

выход (рв, тем, при прочих равных условиях, выше вероятность переноса энергии Ж

2.Спектр флуоресценции донора [^0(У)] должен перекрываться со спектром поглощения акцептора [еА(у)] (условие резонанса). Это прямо следует из закона сохранения энергии. Действительно, в момент переноса энергии количество энергии, которое потерял донор, равно количеству энергии, которое приобрел акцептор. Но энергия, передаваемая донором, равна энергии электронного перехода при испускании фотона, т. е. флуоресценции, а энергия, приобретаемая акцептором, равна энергии фотона, которую этот акцептор должен поглотить, чтобы перейти на уровень возбужденного состояния. Эти энергии могут быть равны только в том случае, если спектр поглощения акцептора перекрывается со спектром излучения донора. Чем сильнее перекрывание спектров, тем больше вероятность переноса энергии и степень перекрывания спектров количественно рассчитывается по формуле:

Эта величина называется интегралом перекрывания. Здесь V — частота, еА

— молярный коэффициент поглощения акцептора, Рв — интенсивность флуоресценции донора в относительных единицах. Использование отношения 5А1)/50, где 50 = РАУ — площадь под кривой флуоресценции донора, позволяет нормировать интенсивности флуоресценции донора при расчете перекрывания спектров.

3. Молекулы донора и акцептора должны находиться на довольно близком расстоянии друг от друга. Теория индуктивно-резонансного переноса энергии, развитая Т. Фѐрстером и С. И. Вавиловым, основана на

46

предположении о взаимодействии возбужденной молекулы донора и невозбужденной молекулы акцептора по механизму диполь — индуцированный диполь. Сила такого взаимодействия обратно пропорциональна шестой степени расстояния между частицами. Константа

скорости переноса энергии, согласно Фѐрстеру, равна

(3'2)

Здесь Ф2 - ориентационный фактор; ффл0 = кфл1)/(кфли + кбо) квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора; *флО = 1/(&фло + ^бо) среднее время жизни молекул донора в отсутствие акцептора; 5АО — интеграл перекрывания спектра флуоресценции донора и спектра поглощения акцептора (уравнение 3.1); — площадь под кривой спектра флуоресценции донора; константа = 90001п 10/(128тс5и4Л0, где п — показатель преломления среды, -^ число Авогадро.

4. Донор и акцептор должны быть удачно ориентированы друг относительно друга (ориентационный фактор Ф2). Если дипольные моменты излучения донора и поглощения акцептора перпендикулярны друг другу, то перенос энергии осуществляться не будет (Ф2 = 0). Если направление моментов совпадает с направлением радиуса-вектора, соединяющего Б* и А, то вероятность переноса максимальна (Ф2 = 4). В растворах при хаотической ориентации молекул и их быстром вращении Ф2 - 2/3.

Вероятность переноса энергии зависит от расстояния (К) между донором и

Изменяя К от 0 до °°, можно найти такое его значение (К0, радиус

Иначе говоря, при К = К0 половина поглотивших фотоны электронновозбужденных молекул донора передаст энергию молекулам акцептора. Найти величину К0 можно, определив нормированный интеграл перекрывания ^АО/^п-

где РОА и .Гц — интенсивность флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора, а ФфлСА и ффл0 — соответствующие квантовые выходы флуоресценции донора. Отсюда

-^/ Уравнения (&2)—(&6 одна молекула донора взаимодействует только с одной молекулой акцептора. Причем все пары донор—акцептор находятся на одинаковых фиксированных расстояниях друг от друга. Такие системы

47

встречаются редко. Однако в растворах мы имеем дело с огромным количеством молекул донора, каждая из которых окружена многими акцепторами, расположенными на случайных расстояниях от этого донора. Каждый донор одновременно взаимодействует не только с ближним, но и с другими акцепторами. Такие ситуации были проанализированы Т. Фѐрстером (1949), и теория подобного взаимодействия получила дальнейшее развитие в работах М. Д. Галанина (1955). Детальный анализ описания переноса энергии в растворах можно найти в монографии Г. Е. Добрецова (1989).

48

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЕЙ

Хемилюминесценцией (ХЛ) называется свечение, сопровождающее химические реакции. Она наблюдается в том случае, если в реакции происходит выделение большого количества энергии, например в реакции взаимодействия двух радикалов или в реакциях с участием перекисей. В последнее время все больший интерес привлекает собственное ("сверхслабое") свечение клеток и тканей животных и человека, которое обусловлено реакциями свободных радикалов: радикалов липидов и кислорода, а также окиси азота, - соединениями, играющими огромную роль в жизни организма, а при определенных условиях - и развитии ряда патологических состояний.

Введение. Энергично протекающие химические реакции сопровождаются, как правило, выделением энергии в форме тепла; существуют, однако такие реакции, которые сопровождаются излучением света. Свечение, сопровождающее химические реакции, называется хемилюминесценцией (ХЛ).

Как правило, хемилюминесценция имеет низкую интенсивность и для ее измерения используют специальные приборы - хемилюминометры. Процессы жизнедеятельности, как теперь стало известно, практически всегда сопровождаются очень слабым излучением, которое иногда называют сверхслабым свечением или собственным излучением клеток и тканей. Некоторые организмы обладают, однако способностью излучать довольно яркий свет, видимый простым глазом; это явление известно с древних времен и получило название "биолюминесценция".

В биохимических системах, т. е. в гомогенатах тканей, суспензиях клеток или клеточных органелл, смесях ферментов и субстратов, собственная хемилюминесценция в большинстве случаев отличается крайне низкой интенсивностью, и требуется особо чувствительная аппаратура, чтобы его обнаружить и измерить. Некоторые вещества, которые в отечественной литературе принято называть активаторами ХЛ (в англоязычной литературе используется термин enhancer), обладают способностью усиливать хемилюминесценцию, иногда во много тысяч раз.

Ниже приведена классификация явлений хемилюминесценции в биологических системах.

Помимо этого, слабым свечением сопровождается образование свободных радикалов при действии ряда физических факторов на объект: при облучении ионизирующей радиации наблюдается радиохемилюминесценция,

49

электролюминесценция, при воздействии ультразвука - сонолюминесценция,

при воздействии сил трения - триболюминесценция. Молекулярный механизм хемилюминесценции

В настоящее время известно довольно много химических реакций, сопровождающихся свечением. В большинстве случаев - это довольно сложные процессы со многими промежуточными стадиями. Но есть несколько простых случаев, в которых механизм превращения энергии химической реакции в свет вполне понятен.

Один из них - это свечение, наблюдаемое при взаимодействии органических радикалов, получаемых электрохимическим путем. В раствор люминесцирующего органического вещества (в опытах брали полициклические углеводороды) в органическом электролите (проводящем электричество) опускали пару электродов, с помощью которых через раствор пропускали электрический ток.

Рис. 1. Хемилюминесценция при рекомбинации катион - и анион-радикалов полициклических углеводородов. 1 - Между электродами, опущенными в раствор органического электролита, прикладывают разность потенциалов. С катода электроны захватываются молекулами и образуются анион-радикалы. На аноде электроны отрываются от молекул и образуются катион-радикалы. 2 - 5 - При взаимодействии катион-радикала и анион-радикала в результате их столкновения (2) электрон переходит с катион-радикала на анион-радикал (3). Однако при этом есть вероятность того, что он окажется не на самом нижнем электронном уровне, а на более высоком. Образуется возбужденная молекула углеводорода (красный кружок на схеме 4). При переходе электрона на более низкий уровень происходит высвечивание кванта света (5).

С катода (-) на молекулы люминесцирующего вещества (обозначим их как НА) переходят электроны и образуются анион-радикалы (заряженные отрицательно). На аноде (+) электроны отнимаются от молекул и образуются катион-радикалы (заряженные положительно, см. рис. 1, вверху). Если теперь раствор перемешать, катион-радикалы будут взаимодействовать с анион- радикалами (рис. 1, внизу); при этом образуется две молекулы исходного углеводорода, одна из которых может оказаться в электронно-возбужденном состоянии и переходит в основное состояние с испусканием кванта света

(фотона).

50