Практическая часть работы

РАБОТА № 1. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ДНК.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является биополимером, который состоит из мономеров – нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из трёх компонентов: азотистого основания, сахара (дезоксирибозы), остатка фосфорной кислоты.

Соединение нуклеотидов в цепь происходит при участии фермента ДНК-полимеразы, которая обеспечивает присоединение каждого последующего нуклеотида через его фосфатную группу к гидроксилу в 3’ положении предыдущего нуклеотида. В результате полинуклеотидная цепь образуется путём образования фосфодиэфирных связей. На одном конце цепи находится фосфатная группа в положении 5’ и на другом – гидроксильная группа в положении 3’.

Полинуклеотидная цепь включает в себя 4 разновидности нуклеотидов, содержащие разные азотистые основания – пуриновые (аденин и гуанин) или пиримидиновые (тимин и цитозин).Название нуклеотида является производным от названия соответствующего азотистого основания. Нуклеотиды и азотистые основания обозначаются заглавными буквами:

Азотистое основание	Название нуклеотида	Обозначение
Аденин	Адениловый	А (A)
Гуанин	Гуаниловый	Г (G)
Тимин	Тимидиловый	Т (T)
Цитозин	Цитидиловый	Ц (C)

Молекула ДНК состоит из двух цепей, закрученных спирально вокруг общей оси. Цепи в молекуле ДНК соединены по принципу комплементарности и антипараллельности.

Принцип комплементарности подразумевает установление водородных связей между строго определенными азотистыми основаниями двух цепей. Аденин соединяется двумя водородными связями с тимином, а гуанин – тремя водородными связями с цитозином. Таким образом, в молекуле ДНК количество пуриновых азотистых оснований всегда соответствует количеству пиримидиновых азотистых оснований (правило Чаргаффа): А+Г = Т+Ц, причём А=Т, а Г=Ц.

Принцип антипараллельности подразумевает, что две полинуклеотидные цепи соединены так, что 5’ конец одной из них соединён с 3’ концом другой и наоборот.

Таким образом, в соответствии с моделью Уотсона и Крика две полинуклеотидные цепочки, соединённые водородными связями между комплементарными азотистыми основаниями, спирально закручены вокруг общей оси. Диаметр такой спирали составляет 2 нм. Длина одного витка – 3,4 нм и он включает в себя 10 пар нуклеотидов. Рассотяние между парами нуклеотидов составляет 0,34 нм. Эти параметры относятся к В-форме (правосторонняя) ДНК.

В любой живой системе ДНК выполняет следующие функции:

1. хранение наследственной информации в виде последовательности нуклеотидов (генетический код), которая определяет последовательность аминокислот в полипептидной цепи и свойства белка;

2. передача наследственного материала происходит путем репликации ДНК;

3. реализация наследственной информации в процессе синтеза белка.

Задание № 1:

• внимательно прочитайте содержание работы № 1;

• изучите и зарисуйте схему строения нуклеотида.

Нуклеозид = пентоза + азотистое основание Нуклеотид = нуклеозид + фосфорная кислота = азотистое основание+ пентоза+фосфорная кислота. В РНК пентоза - рибоза В ДНК пентоза - дезоксирибоза

Рис. 1. Схема строения нуклеотида

Задание № 2:

• изучите и зарисуйте схему соединения нуклеотидов в полинуклеотидную цепь.

Нуклеотиды соединяются друг с другом в полимерную цепочку с помощью фосфодиэфирных связей. Азотистые основания не принимают участия в соединении нуклеотидов одной цепи.

Рис. 2. Схема соединения нуклеотидов в полинуклеотидную цепь

Задание № 3:

• изучите и зарисуйте схему строения молекулы ДНК.

Рис. 3. Схема строения ДНК

РАБОТА № 2. РЕПЛИКАЦИЯ (РЕДУПЛИКАЦИЯ) ДНК

Репликация ДНК — процесс самоудвоения, главное свойство молекулы ДНК. Репликация относится к категории реакций матричного синтеза, идет с участием ферментов. Под действием ферментов молекула ДНК раскручивается, и около каждой цепи, выступающей в роли матрицы, по принципам комплементарности и антипараллельности достраивается новая цепь. Таким образом, в каждой дочерней ДНК одна цепь является материнской, а вторая — вновь синтезированной. Такой способ синтеза называется полуконсервативным.

«Строительным материалом» и источником энергии для репликации являются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), содержащие три остатка фосфорной кислоты. При включении дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в полинуклеотидную цепь два концевых остатка фосфорной кислоты отщепляются, и освободившаяся энергия используется на образование фосфодиэфирной связи между нуклеотидами.

В репликации участвуют следующие ферменты:

1. ДНК-геликазы («расплетают» ДНК);

2. Дестабилизирующие белки;

3. ДНК-топоизомеразы (разрезают ДНК);

4. ДНК-полимеразы (подбирают дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и комплементарно присоединяют их к матричной цепи ДНК);

5. РНК-праймазы (образуют РНК-затравки, праймеры);

6. ДНК-лигазы (сшивают фрагменты ДНК).

С помощью геликаз в определенных участках ДНК расплетается, одноцепочечные участки ДНК связываются дестабилизирующими белками, образуется репликационная вилка. При расхождении 10 пар нуклеотидов (один виток спирали) молекула ДНК должна совершить полный оборот вокруг своей оси. Чтобы предотвратить это вращение ДНК-топоизомераза разрезает одну цепь ДНК, что дает ей возможность вращаться вокруг второй цепи.

ДНК-полимераза может присоединять нуклеотид только к 3'-углероду дезоксирибозы предыдущего нуклеотида, поэтому данный фермент способен передвигаться по матричной ДНК только в одном направлении: от 3'-конца к 5'-концу этой матричной ДНК. Так как в материнской ДНК цепи антипараллельны, то на ее разных цепях сборка дочерних полинуклеотидных цепей происходит по-разному и в противоположных направлениях. На цепи 3'–5' синтез дочерней полинуклеотидной цепи идет без перерывов; эта дочерняя цепь будет называться лидирующей. На цепи 5'–3' - прерывисто, фрагментами (фрагменты Оказаки), которые после завершения репликации ДНК-лигазами сшиваются в одну цепь; эта дочерняя цепь будет называться запаздывающей (отстающей).

Особенностью ДНК-полимеразы является то, что она может начинать свою работу только с «затравки» (праймера). Роль «затравок» выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участи фермента РНК-праймазы и спаренные с матричной ДНК. РНК-затравки после окончания сборки полинуклеотидных цепочек удаляются.

Репликация протекает сходно у прокариот и эукариот. Скорость синтеза ДНК у прокариот на порядок выше (1000 нуклеотидов в секунду), чем у эукариот (100 нуклеотидов в секунду). Репликация начинается одновременно в нескольких участках молекулы ДНК. Фрагмент ДНК от одной точки начала репликации до другой образует единицу репликации — репликон.

Репликация происходит перед делением клетки, в S-период интерфазы. Благодаря этой способности ДНК осуществляется передача наследственной информации от материнской клетки дочерним.

Задание №5:

• внимательно изучите содержание работы № 2;

• зарисуйте и обозначьте схему репликации ДНК.

Рис. 4. Схема репликации ДНК

РАБОТА № 3. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ РНК.

Наследственная информация, записанная с помощью генетического кода, хранится в молекуле ДНК. Процессы жизнедеятельности осуществляются в клетке на основе полученной информации, однако в этих процессах участвует не сама ДНК, а РНК, выполняющая роль посредника.

Рибонуклеиновые кислоты (РНК), присутствующие в клетках как прокариот, так и эукариот, бывают трёх основных типов: информационная (матричная) РНК, транспортная РНК, рибосомная РНК. В ядре клеток эукариот также содержится гетерогенная ядерная РНК.

В отличие от молекулы ДНК, РНК представляет собой одну полинуклеотидную цепь, включающую 4 разновидности нуклеотидов, содержащих остаток фосфорной кислоты, сахар – рибозу и одно из четырёх азотистых оснований – аденин, гуанин, цитозин и урацил (вместо тимина).

Все виды РНК представляют собой неразветвленные полинуклеотиды, имеют специфическую пространственную конформацию и принимают участие в процессах синтеза белка. Информация о строении всех видов РНК хранится в ДНК. Процесс синтеза РНК на матрице ДНК называется транскрипцией.

Транспортные РНК содержат обычно 76 (от 75 до 95) нуклеотидов; молекулярная масса — 25 000–30 000. На долю тРНК приходится около 10% от общего содержания РНК в клетке.

Функции тРНК: 1) транспорт аминокислот к месту синтеза белка, к рибосомам, 2) трансляционный посредник. В клетке встречается около 40 видов тРНК, каждый из них имеет характерную только для него последовательность нуклеотидов. Однако у всех тРНК имеется несколько внутримолекулярных комплементарных участков, из-за которых тРНК приобретают конформацию, напоминающую по форме лист клевера. У любой тРНК есть петля для контакта с рибосомой (1), антикодоновая петля (2), петля для контакта с ферментом (3), акцепторный стебель (4), антикодон (5) (см. рис. 6). Аминокислота присоединяется к 3'-концу акцепторного стебля. Антикодон — три нуклеотида, «опознающие» кодон иРНК. Следует подчеркнуть, что конкретная тРНК может транспортировать строго определенную аминокислоту, соответствующую ее антикодону. Специфичность соединения аминокислоты и тРНК достигается благодаря свойствам фермента аминоацил-тРНК-синтетаза.

Рибосомные РНК содержат 3000–5000 нуклеотидов; молекулярная масса — 1 000 000–1 500 000. На долю рРНК приходится 80–85% от общего содержания РНК в клетке. В комплексе с рибосомными белками рРНК образует рибосомы — органоиды, осуществляющие синтез белка. В эукариотических клетках синтез рРНК происходит в ядрышках.

Функции рРНК: 1) необходимый структурный компонент рибосом и, таким образом, обеспечение функционирования рибосом; 2) обеспечение взаимодействия рибосомы и тРНК; 3) первоначальное связывание рибосомы и кодона-инициатора иРНК и определение рамки считывания, 4) формирование активного центра рибосомы.

Информационные РНК разнообразны по содержанию нуклеотидов и молекулярной массе (от 50 000 до 4 000 000). На долю иРНК приходится до 5% от общего содержания РНК в клетке.

Функции иРНК: 1) перенос генетической информации от ДНК к рибосомам, 2) матрица для синтеза молекулы белка, 3) определение аминокислотной последовательности первичной структуры белковой молекулы.

Задание № 6:

• изучите и зарисуйте схему строения нуклеотида РНК (рис. 5);

• изучите и зарисуйте схему строения молекулы тРНК (рис. 6).

Нуклеотиды РНК содержат остаток фосфорной кислоты, сахар – рибозу и одно из четырёх азотистых оснований – аденин, гуанин, цитозин и урацил (вместо тимина).

Рис. 5. Схема строения нуклеотида РНК

Рис. 6. Схема строения молекулы транспортной РНК

Задание № 7:

• в рабочей тетради заполните таблицу:

	ДНК	иРНК	тРНК	рРНК
1. Пуриновые основания (название, символы)
2. Пиримидиновые основания (название, символы)
3. Пентоза
4. Локализация в клетке
5. Функции

РАБОТА № 4. ПРИНЦИП ОБЕСПЕЧЕНИЯ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

Задание № 8:

• совместно с преподавателем разберите решение следующих задач:

а) Принцип комплементарности.

Одна из цепей участка молекулы ДНК имеет следующий состав нуклеотидов: АТГЦААЦЦТТГТТАЦТ. Напишите последовательность нуклеотидов комплементарной цепи РНК.

б) Репликация ДНК.

Участок ДНК имеет следующий состав нуклеотидов:

3'...ЦГАТГТАЦГГЦАТГА... 5'

5'...ГЦТАЦАТГЦЦГТАЦТ... 3'

Напишите нуклеотидный состав дочерних ДНК, образовавшихся в результате репликации исходного фрагмента ДНК.

в) Принцип транскрипции.

Одна из цепей фрагмента ДНК имеет следующую последовательность нуклеотидов: 3' ...ЦАТТТАГЦТЦАТАГЦЦАТГАЦ…5'. Напишите последовательность нуклеотидов и-РНК, закодированной в данном фрагменте. Как называется синтез и-РНК на матрице ДНК?

г) Принцип трансляции.

Кодирующая зона участка и-РНК имеет следующий состав нуклеотидов:

3'...ЦЦГУУУЦГААУЦГУААЦГ... 5'.

Напишите первичную структуру полипептида, закодированного в данном отрезке и-РНК (используя таблицу генетического кода). Как называется синтез первичной структуры полипептида на матрице и-РНК?

Задание № 9:

• самостоятельно решите следующие задачи, решение оформите в рабочей тетради:

1. В одной из цепей фрагмента ДНК нуклеотиды расположены в следующей последовательности 3' ... ЦЦЦГЦЦАЦЦТГЦГГА...5'. Напишите последовательности нуклеотидов в комплементарной цепи ДНК.

2. Гемоглобин взрослого человека Нв А-белок-тетрамер, состоящий из двух α- и двух β-полипептидных цепей, α цепь включает 141 аминокислоту, β-цепь – 146. Сколько пар нуклеотидов входит в состав экзонов генов α- и β-цепей гемоглобина А?

3. Оперон фермента РНК – полимеразы кишечной палочки включает 9450 пар нуклеотидов, РНК – полимераза состоит из 329 аминокислот. Сколько кодирующих и некодирующих пар нуклеотидов входит в состав оперона РНК полимеразы?

4. Белок В – мономер. Ген, кодирующий этот белок, включает 5 интронов по 10 тысяч пар нуклеотидов и 4 экзона по 270 пар нуклеотидов.

а) Сколько нуклеотидов входит в состав кодирующей зоны и-РНК данного белка?

б) Сколько пар нуклеотидов (экзонов и интронов) входит в состав данного гена?

в) Сколько аминокислот входит в состав данного белка?

5. Сколько пар нуклеотидов входит в состав экзонов α и β цепей белка А, если известно, что α цепь состоит из 100 аминокислот, а β – цепь включает в себя 150 аминокислот.

6. В начальном фрагменте первого экзона гена  – полипептидной цепи нормального гемоглобина человека (Нв А) имеется следующая последовательность нуклеотидов:

3'... ЦАЦГТАААТГАГГААТЦЦТЦТТТГ…5'.

а) Какие аминокислоты кодируют 1, 3, 6 и 8 кодоны?

б) Как изменится аминокислотный состав этого белка, если в третьем кодоне второе основание будет заменено на Г?

в) В пятом кодоне произойдет делеция первого основания?

7. В первом экзоне гена -глобиновой цепи гемоглобина А-взрослого человека начальные нуклеотиды кодирующей ДНК расположены в следующей последовательности:

5'... ЦАЦГТАААТТТАГГАЦТЦЦТЦТТТ…3'.

Как изменится аминокислотный состав -полипептидной цепи этого белка, если произойдет одна из следующих мутаций:

а) В третьем кодоне второе основание будет заменено на Г?

б) В четвертом кодоне второе основание будет заменено на Г?

в) В пятом кодоне первое основание выпадает (произойдет делеция)?

8. Четвертый пептид в нормальном гемоглобине состоит из следующих аминокислот: валин-гистидин-лейцин-треонин-пролин-глутаминовая кислота-глутаминовая кислота-лизин. У больного с симптомом спленомегамии при умеренной анемии обнаружили следующий состав четвертого пептида: валин-гистидин-лейцин-треонин-пролин-лизин-глутаминовая кислота-лизин. Определите изменение в участке ДНК, кодирующем четвертый пептид гемоглобина, приведшее к заболеванию.

Вопросы для самоконтроля:

1. На какие группы в зависимости от организации наследственного материала подразделяются все организмы, имеющие клеточное строение?

2. Перечислите отличительные признаки прокариот.

3. Перечислите отличительные признаки эукариот.

4. Назовите компоненты потока информации в клетке.

5. Что является мономерами белков?

6. Сколько видов аминокислот участвуют в синтезе белков?

7. Назовите уровни организации наследственного материала.

8. Что такое генетический код?

9. Сколько всего кодонов в генетическом коде?

10. Сколько кодонов генетического кода кодируют аминокислоты?

11. Сколько аминокислот кодирует один кодон?

12. Охарактеризуйте первичную, вторичную и третичную структуры молекулы ДНК.

13. При помощи каких связей соединяются нуклеотиды в полинуклеотидную цепь?

14. Что является мономерами ДНК?

15. Сколько нуклеотидов входит в состав кодона генетического кода?

16. Напишите комплементарные пары азотистых оснований ДНК.

17. Какое свойство ДНК обеспечивает сохранность наследственной информации при делении клеток?

18. Что входит в состав нуклеотида?

19. Какие виды РНК известны?

20. В какую фазу митотического цикла происходит репликация ДНК?

21. Какая пентоза входит в состав нуклеотида РНК?

22. Какой вид РНК переносит аминокислоты к рибосомам? Сколько их видов?

23. Назовите пуриновые и пиримидиновые основания ДНК.

24. По какому принципу соединяются азотистые основания нуклеотидных цепей ДНК?

25. Какой вид РНК переносит информацию от ДНК на белок?