
- •3513 Практикум з мікробіології, вірусології та імунології
- •Частина 1 Загальна бактеріологія та імунологія
- •Передмова
- •Cписок скорочень
- •Правила роботи у бактеріологічній лабораторії. Морфологія бактерій. Світлова мікроскопія з використанням імерсійного об’єктива. Прості методи фарбування препаратів
- •Дeмонстрація
- •1. Бактеріологічний посуд: бактеріологічна петля (рис. 1д), чашка Петрі (рис. 1а), пробірки, градуйовані піпетки, колби
- •2. Предметні та покривні скельця (рис. 1б, в). Скельця з лунками. Спиртівка. Пісочний годинник, олівець “для скла”
- •3. Мікроскоп. Імерсійне масло
- •Правила роботи з імерсійною системою
- •Можливі помилки під час роботи з мікроскопом
- •Догляд за мікроскопом
- •Пояснення до самостійної роботи з теми:
- •Загальна будова навчального світлового мікроскопа
- •2. Будова бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. Фарбування за методом Грама. Мікроскопічний метод діагностики збудників інфекційних захворювань
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «будова бактеріальної клітини. Складні методи фарбування. Фарбування за методом Грама. Мікроскопічний метод діагностики інфекційних захворювань»
- •Спори та методи їх виявлення
- •Капсула
- •Класифікація бактерій за кількістю і розташуванням джгутиків
- •Методи виявлення джгутиків у бактерій
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •Пояснення до самостійної роботи з теми
- •«Особливості ультраструктури спірохет,
- •Рикетсій, хламідій, мікоплазм.
- •Сучасні методи мікроскопічного дослідження»
- •Звивисті форми бактерій
- •Загальна схема будови Treponema pallidum
- •4. Основи асептики та антисептики. Дезінфекція. Стерилізація
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •3. Автоклав
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «основи асептики та антисептики. Дезінфекція. Стерилізація»
- •Види та завдання дезінфекції
- •Практична робота студентів
- •Пояснення до самостійної роботи з теми
- •«Фізіологія бактерій.
- •Перший етап бактеріологіного методу діагностики.
- •Біологічний метод діагностики»
- •Метаболізм
- •Конструктивний (анаболізм) Енергетичний (катаболізм)
- •6. Ріст та розмноження мікроорганізмів.
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «ріст та розмноження мікроорганізмів.
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «ііі – IV етап виділення чистої культури аеробних бактерій. Ферменти бактерій. Антибіотики»
- •8. Облігатні Анаероби. Виділення чистої культури
- •3. Метод Фортнера
- •4. Ріст Cl. Perfingens на середовищі Вільсон-Блера
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «облігатні Анаероби. Виділення чистої культури облігатних анаеробних бактерій»
- •V етап Врахування та аналіз результатів дослідження. Відповідь
- •9. Бактеріофаги. Генетика бактерій
- •Теоретичні питання
- •Практична робота студентів
- •Демонстрація
- •5 . Дослід із виявлення множинної стійкості мікроорганізмів до антибіотиків
- •2 Мл культури реципієнта (f-)
- •1 Мл бульйонної культури реципієнта
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «бактеріофаги та їх практичне використання. Генетика бактерій»
- •Бактеріофаги та їх практичне використання. Генетика бактерій
- •Перевага методу плр – полімеразної ланцюгової реакції для діагностики інфекційних захворювань
- •10. Нормальна мікрофлора тіла людини. Дисбактеріоз
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •3.1. Замалюйте мікроскопічні препарати.
- •3.2. Бакпечатка для вивчення мікрофлори тіла людини
- •3.3. Біологічні препарати (еубіотики): колібактерин, лактобактерин, біфідумбактерин, біфікол.
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «нормальна мікрофлора тіла людини. Дисбактеріоз. Вчення про інфекцію»
- •Дисбактеріоз
- •11. Вчення про інфекцію
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •1. Виявлення гемолітичної властивості бактерій
- •2. Виявлення плазмокоагулазної активності бактерій
- •4. Виявлення лецитовітелазної активності
- •Демонстрація
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «нормальна мікрофлора тіла людини. Дисбактеріоз. Вчення про інфекцію»
- •12. Імунітет. Фактори і механізми вродженого захисту організму
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •2. Фагоцитоз у новонародженої і дорослої людини
- •3. Визначення бактерицидної активності сироватки крові
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «імунітет. Фактори і механізми вродженого захисту організму»
- •Особливості імунної системи
- •13. Антигени
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація Діагностичні препарати: Діагностикуми і антигени
- •Алергени для шкірноалергічних проб
- •Лікувально-профілактичні препарати
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «антигени»
- •Класифікація антигенів
- •Антигени – сторонні макромолекули
- •Інфекційні
- •14. Адаптивна гуморальна імунна відповідь. Імуноглобуліни (антитіла). Серологічні реакції флокуляції, нейтралізації
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •1. Імунні сироватки (антитоксичні) та імуноглобуліни
- •2. Титрування антитоксичної сироватки методом флокуляції
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «гуморальна імунна відповідь. Імуноглобуліни (антитіла). Серологічні реакції флокуляції, нейтралізації»
- •Набутий (адаптивний) імунітет
- •Практична робота
- •Демонстрація
- •1. Реакція непрямої гемаглютинації (рнга)
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «серологічні реакції: реакція зв’язування комплементу (рзк), реакції з використанням мічених антитіл та антигенів – іфа, ріф, ріа»
- •16. Адаптивна клітинна імунна відповідь. Імунологічна толерантність. Регуляція імунної відповіді
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «адаптивна клітинна імунна відповідь. Імунологічна толерантність. Регуляція імунної відповіді»
- •Механізм цитотоксичної дії т-кілера на клітину-мішень
- •17. Оцінка імунного статусу людини. Принципи функціонування імунної системи
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «оцінка імунного статусу людини. Принципи функціонування імунної системи»
- •18. Протиінфекційний імунітет
- •Теоретичне питання
- •Практична робота
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «протиінфекційний імунітет»
- •Антигенспецифічна імунна відповідь
- •Зв’зок типу імунної відповіді з локалізацією інфекційних агентів
- •19. Патологія імунної системи
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «патологія імунної системи»
- •Типи алергічних реакцій
- •20. Специфічна профілактика та терапія інфекційних захворювань. Лікувальні, профілактичні та діагностичні імунологічні препарати
- •Теоретичні питання
- •Практична робота
- •Діагностичні препарати
- •Пояснення до самостійної роботи з теми «специфічна профілактика і терапія інфекційних захворювань. Лікувальні, профілактичні та діагностичні імунологічні препарати»
- •Список рекомендованої літератури
- •Практикум з мікробіології, вірусології та імунології
- •Частина 1 Загальна бактеріологія та імунологія
Діагностичні препарати
При проведенні діагностики інфекційних захворювань широко використовуються імунологічні методи дослідження, які дозволяють за допомогою серологічних реакцій підтвердити клінічний діагноз, а також вид збудника.
Використання цих методів можливо тільки за наявності високоякісних препаратів, до яких належать антигени, діагностикуми, алергени, діагностичні сироватки та імуноглобуліни.
Проведення серологічних реакцій ґрунтується на специфічності зазначених препаратів. Тобто за допомогою відомого антигену в сироватці крові виявляють відповідні, специфічні до нього антитіла і, навпаки, за допомогою відомих антитіл (діагностичні сироватки) виявляють відповідні (специфічні) антигени.
Діагностикуми і антигени
Доведено, що всі антигени відносно до антитіл мають специфічність, тобто антиген взаємодіє тільки з тими антитілами (імунною сироваткою), які синтезувалися в організмі під впливом цього антигену.
З цієї закономірності випливає практичний висновок: за допомогою відомого антигену можна виявити відповідні (специфічні) до нього антитіла в досліджуваній сироватці крові. Цей метод одержав назву – серологічна діагностика інфекційних захворювань. Антигенами є корпускули (клітини) мікроорганізмів, стандартизована завись яких називається діагностикум.
Антигенами є також специфічні білки, полісахариди, одержані з клітин мікроорганізмів. Залежно від походження розрізняють бактеріальні, рикетсіозні та вірусні діагностикуми.
У практиці широко використовують еритроцитарні діагностикуми, які готують шляхом адсорбції мікроорганізмів або окремих антигенів на поверхні овечих еритроцитів.
Усі антигени та діагностикуми, включаючи еритроцитарні, використовують для серологічної діагностики інфекційних захворювань. Антигени використовують при проведенні реакції зв’язування комплементу (РЗК), реакції преципітації (РП), імуноферментного аналізу та ін. реакцій.
Діагностикуми використовують при проведенні реакції аглютинації (на склі і розгорнутої), еритроцитарні діагностикуми – при проведенні реакції непрямої (пасивної) гемаглютинації.
Приклади діагностикумів і антигенів, які використовують у серологічній лабораторії:
бруцельозний діагностикум (завись бруцел, убитих формаліном або нагріванням);
дизентерійні діагностикуми (Зонне і Флекснера) містять завись дизентерійних бактерій, убитих формаліном;
сальмонельозні діагностикуми (завись сальмонел, убитих формаліном);
черевнотифозні О-, Н-, ОН-діагностикуми;
еритроцитарний черевнотифозний Vi-діагностикум;
туляремійний діагностикум (завись туляремійних бактерій, убитих формаліном);
рикетсіозні діагностикуми (завись рикетсій, вирощених у жовточному мішку курячого ембріона);
еритроцитарний сальмонельозний О-діагностикум;
еритроцитарний кашлюковий діагностикум;
гонококовий антиген;
розчинний кашлюковий антиген;
полісахаридний антиген із грибів Candida albicans.
Приклад опису гонококового антигену – антигенвмісний препарат, який використовують з діагностичною метою в реакції зв’язування комплементу для визначення титру специфічних антитіл.
Діагностичні сироватки
Другий компонент імунологічних реакцій антитіла також мають сецифічність, тобто здатність вступати в реакцію та утворювати комплекс тільки з тими антигенами, під впливом яких вони синтезувалися в організмі.
Це дозволяє використовувати імунні сироватки, які містять відомі за специфічністю антитіла, для визначення антигенів (мікроорганізмів) у серологічних реакціях.
Імунні сироватки, які використовують для визначення виду інфекційного захворювання, називаються діагностичними.
Методи серологічної ідентифікації мікроорганізмів грунтуються на властивості антитіл, які містяться в діагностичних сироватках, вибірково з'єднуватися з комплементарними антигенами мікроороганізмів.
Діагностичні сироватки одержують шляхом імунізації лабораторних тварин (кроликів) мікробними зависями, суспензіями вірусів, анатоксинами, окремими очищеними антигенами збудників. Імунізацію проводять за спеціальною схемою. Потім тварин обезкровлюють, сироватку відокремлюють від кров'яного згустка та визначають титр антитіл у серологічній реакції. Титр антитіл – це найбільше розведення сироватки, де ще відмічається позитивна реакція.
Діагностичні сироватки використовують для:
Експрес-діагностики (індикації) збудника в матеріалі від хворих і в різних об’єктах зовнішнього середовища.
Ідентифікації збудника в чистій культурі – на завершальному етапі бактеріологічного дослідження.
Для експрес-діагностики використовують мічені (флуоресціюючі) сироватки, антитіла в яких з’єднані (кон’юговані) з флюорохромом, який дає світіння під впливом ультрафіолетового проміння. Досліджувальний матеріал фіксують на предметному склі, потім наносять мічену сироватку зі специфічними антитілами і через 30 – 40 хвилин обережно змивають водою, сушать і мікроскопіюють за допомогою люмінісцентного мікроскопа. Якщо утворився комплекс антитіл з антигеном (мікробом), то в полі зору видно мікроорганізми, які світяться, наприклад палички збудника.
Приклади флуоресціюючих (мічених) сироваток:
флуоресціюючі протихолерні антитіла являють собою мічені флюорохромом гамма-глобулінові фракції аглютинуючої О-сироватки;
флуоресціюючі протичумні антитіла;
суха флуоресціююча сироватка проти сибірки та ін.
Використовується також метод непрямої люмінесцентної мікроскопії, при якій на препарат на склі спочатку наносять звичайну (нефлуоресціюючу) діагностичну сироватку. Потім змивають нанесену сироватку та наносять мічену антиглобулінову видову сироватку (до гамма-глобулінів тварин, яка була використана для одержання діагностичної сироватки). Таким чином одержують комплекс, який складається із антигену, на якому сорбовані специфічні антитіла, які, у свою чергу, оточені флуоресціюючими антитілами, що світяться.
Для непрямої імунолюмінесцентної мікроскопії випускаються флуоресціюючі антивидові сироватки проти глобулінів-коней, кролика і деяких тварин. Флуоресціюючі сироватки випускаються в ампулах у вигляді ліофільно висушеного препарату.
З діагностичною метою у більшості випадків для виявлення специфічних антигенів використовують преципітуючі сироватки. Реакція преципітації може бути поставлена в преципітаційних пробірках або в гелі. Прикладом класичного методу є реакція Асколі для виявлення сибіркового антигену (іноді чумного, туляремійного, менінгококового), а також визначення видової належності кров’яної плями в судово-медичній практиці.
Преципітація в гелі використовується для кількісного визначення імуноглобулінів різних класів (IgM, IgG, IgA) у крові та інших біологічних рідинах здорових або хворих людей із метою оцінки стану гуморального імунітету.
Для ідентифікації збудників у чистій культурі на завершальному етапі бактеріологічного дослідження використовують здебільшого аглютинуючі сироватки. Приклади таких сироваток:
аглютинуючі адсорбовані сальмонельозні О- і Н-сироватки;
аглютинуючі ОК-сироватки проти ентеропатогенних типів кишкових паличок;
аглютинуючі холерні О, ОН, Огава, Інаба-сироватки.
Приклад опису аглютинуючої адсорбованої сальмонельозної О-сироватки – антитільний препарат, який використовується з діагностичною метою в реакції аглютинації на склі для вивчення антигенної структури сальмонел. Сироватка отримана шляхом гіперімунізації кролів О-антигеном.