8. Облігатні Анаероби. Виділення чистої культури

ОБЛІГАТНИХ анаеробних бактерій

Актуальність теми: бактеріологічний метод діагностики є основним методом мікробіологічної діагностики анаеробних інфекційних захворювань, таких як, газова гангрена, правець, тому знати та вміти його проводити починаючи з відбору матеріалу для посіву та оцінювати результати повинен кожний досвідчений лікар.

Мета (загальна) – вміти культивувати анаеробні мікроорганізми на поживних середовищах, виділяти чисту культуру та оцінювати результати тестів ідентифікації.

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1. Цілі та методи культивування облігатних анаеробних бактерій.

2. Поживні середовища для культивування облігатних анаеробів.

3. Способи створення анаеробних умов.

4. Етапи виділення чистих культур облігатних анаеробних бактерій.

5. Способи ідентифікації виділених культур облігатних анаеробних бактерій.

ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ

Робота 1. Вивчити та зарисувати демонстрацію у протокол

Демонстрація

1. Поживні середовища для культивування анаеробів: цукровий агар стовпчиком, цукровий бульйон, молоко за Тукаєвим, середовище Кітта-Тароцці, середовище Вільсон-Блера, агар Цейслера.

Культивування анаеробів проводять убезкисневих умовах. Відношення до кисню можна визначити при посіві культури уколом у стовпчик агару. Аероби виростуть на поверхні середовища, ріст анаеробів відбувається у глибоких шарах поживного середовища. Мікроорганізми проміжної групи (факультативні анаероби) ростуть як на поверхні середовища, так і в глибині нього.

Для редукції та поглинання кисню до поживних середовищ перед їх стерилізацією додають шматочки печінки, селезінки, м'язової тканини, тканини мозку, яєчного білка і навіть шматочки вати. Як редукуючу субстанцію до поживного середовища додають сульфат заліза, сульфат натрію, сульфат амонієвого заліза та ін.

Рисунок 47 – Середовище Вільсона-Блера

Анаеробні умови створюються на поживних середовищах також шляхом збагачення їх вуглеводними сполуками (молочний цукор, виноградний цукор та ін.). У процесі росту анаероби окиснюють ці сполуки, концентрація вільного кисню знижується.

Культивувати анаероби можна на цукровому агарі стовпчиком. Агаріз глюкозою наливають у пробірку високим стовпчиком до 2/3 її об'єму, охолоджують до 42–45 °C. Досліджуваний матеріал додають до агару, ретельно перемішують. Пробірку ставлять у склянку з холодною водою. Середовище застигає, і всередині нього (особливо у нижній частині пробірки) створюються надійні анаеробні умови. При вирощуванні в рідких середовищах (цукровому бульйоні, молоці, печінковому бульйоні та ін.) звертають увагу на газоутворення, інтенсивність росту та характер осаду.

Для виділення чистих культур анаеробів широко застосовуються середовища Вільсона-Блератаагар Цейсслера.Середовище Вільсона-Блераготують з м'ясопептонного агару, до якого додають глюкозу,Na₂SO₃, хлористе залізоFeCl₂.Кров'яний агар Цейсслераскладається з м'ясопептонного агару, 1% глюкози та 20% свіжої дефібринованої крові.Cl. perfringensутворює зону гемолізу навколо колонії. Посіви на середовищі Цейсслера розглядають через 10–24 годинупродовж наступних 4–6 діб.

Середовище Кітта-Тароцці – це поживний бульйон з глюкозою та шматочками свіжих органів тварин. Глюкоза та шматочки органів мають редукуючу властивість. Зверху середовище заливають шаром стерильного вазелінового масла.

2. Анаеростат, апарат Аристовського, ексикатор

Мікроанаеростатявляє собою циліндричну, металеву або пластмасову ємність об'ємом 2,5 (3–7) літрів, яка герметично закривається, використовується для інкубації посівів в анаеробних умовах.

Безкисневі умови в мікроанаеростаті створюються одним із двох способів:

1) вакуумзаміщеннямстворюють вакуум і заповнюють анаеробним газом;

2) хімічним зв'язуванням кисню. Для хімічного зв'язування кисню використовують газогенерувальнісистеми, які після додавання води генерують Н₂і СО². Н₂зв'язує внаявності паладієвого каталізатора вільний кисень з утворенням води. Генерований СО₂необхідний для стимуляції росту анаеробів, які є капнофілами. Останнім часом використовують системи, що зв'язують кисень за рахунок окиснення сполук заліза. Створення безкисневих умов в мікроанаеростатах контролюється індикаторною тест-смужкою, яка знебарвлюється в разі утворення безкисневої атмосфери.

Рисунок 48 – Мікроанаеростат

Апарат Аристовськогоскладається з металевого циліндра та герметичної кришки. У циліндр поміщають металеву підставку у вигляді напіввідерця, на яку поміщають чашки з посівами та половинку чашок з хімічним поглиначем киснево-зволоженої суміші гідрокарбонату натрію та гідросульфіту натрію.

Рисунок 49 – Апарат Аристовського

Ексикатор– товстостінна скляна ємність з притертою кришкою та підставкою для чашок Петрі. На дно ексикатора ставлять запаленусвічкуабо розміщують хімічні поглиначі. Потім посіви ставлять в ексикатор. Притерті поверхні ємності і кришки змащують тонким шаром вазеліну і закривають кришкою.

Рисунок 50 – Ексикатор Аристовського