1. Культивирование вирусов в организме лабораторных животных.

Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются «пассажами».

Индикацию, т.е. обнаружение факта репликации вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено, в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных научных целях.

2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.

Большинство известных вирусов обладают способностью реплицироваться в курином эмбрионе. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Репродукция вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

3. Культивирование вирусов в тканевых культурах.

Клеточная культура– система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии.

Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Сущность методов при приготовлении первичных культур тканей заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщения клеток для последующего получения монослоя. Разобщение клеток проводится путём воздействияна ткань протеолитических ферментов (трипсина).

Для культивирования культуры клеток применяют синтетические питательные среды – 199, Игла, Хенкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли). Смена питательной среды проводится через 2-3 дня.

1. первичные (трипсинизированные) культуры клеток – у которых межклеточные связи разрушают ферментами (трипсином, панкреатином) и получают монослой клеток на стекле.

2. Перевиваемые (стабильные):

а) нормальные (ПКБ – почки барана; СОЦ – сердце обезьяны циномольгус);

б) опухолевые – Hela– рак шейки матки;Hep–1 – эпидермоидный рак гортани; Дейтройт 6 – костный мозг больного раком легкого.

О наличии вирусав зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом:

1. дегенерация клеток (округление, изменение формы, разрушение);

2. появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец (Бабеша-Негри – вирус бешенства);

3. разрушение пласта клеток (парамиксовирусы);

4. образование гигантских многоядерных клеток - симпластов (вирус кори).

5. Образование «негативных колоний», или «бляшкообразование» – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культуре клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона.

Основные методы индикации вирусов в культуре тканей:

1. “+” гемагглютинация;

2.“+” гемадсорбция;

3.реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей;

4.цветная реакция Солка.

Реакция гемагглютинации– склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”).

Реакция гемадсорбции– адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа– вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа).

Цветная реакция Солка– основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клеток в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются, и подавляется их метаболизм, т.е. цвет средынеизменяется.

Основные пути передачи вирусов:

• воздушно-капельный (вирус гриппа, вирус натуральной оспы);

• пищевой (вирус полиомиелита, вирус гепатита А);

• контактно-бытовой (вирус бешенства, герпесвирусы);

• трансмиссивный (вирус клещевого энцефалита);

• гематогенный (ВИЧ, вирус гепатита В, С).

Методы диагностики вирусных заболеваний.

1. Вирусоскопический– в исследуемом материале с помощью электронной микро-скопии обнаруживаются вирионы, а с помощью светооптической – внутриклеточные включения (недостаток светооптической микроскопии – не специфичность).

2. Метод иммунной электронной микроскопии– специфичный, чувствительный и надежный метод. В основе лежит взаимодействие антител (Ат) с вирусами при смешивании материала со специфической сывороткой. В результате образуются микропреципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых «венчиком» (метод громоздкий и не применяется для массовых исследований).

3. Вирусологический – выделение и идентификация вирусов с использованием клеточных культур или куриных эмбрионов, заражением лабораторных животных.

Методы идентификации вирусов:

1. нейтрализации цитопатического действия (ЦПД);

2. нейтрализация реакции гемадсорбции;

3. торможение реакции гемагглютинации;

4. нейтрализация в опытах на животных.

Для идентификации применяется типоспецифические сыворотки.

4. Серологические– для обнаружения как специфических Ат, так и вирусных Аг:

1. РСК;

2. РПГА;

3. РТГА;

4. реакция гемагглютинации иммунного прилипания (Аг+Ат в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах);

5. РН вирусов;

6. радиоиммунный метод;

7. ИФА.

5. Иммунофлуоресцентный метод(ускоренная диагностика).

6. Биологический метод.

7. Иммунохроматографический анализ.

8. Метод ДНК-зондов (гибридизация)в основе лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Гибридизация осуществляется на нитроцеллюлозной мембране (твердая подложка). Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кислот. ДНК денатурируют, а образовавшиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, который представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация (спаривание) произойдет, если между зондом и нитью ДНК есть гомология.

9. ПЦР(полимеразная цепная реакция) - данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей.

Конкретные цели:

• Трактовать морфологию и ультраструктуру вирусов.

• Ознакомиться с классификацией вирусов.

• Анализировать особенности взаимодействия вирусов с живыми системами.

• Оценивать результаты репликации вирусов в живых системах.

• Анализировать методы культивирования вирусов в лабораторных условиях.

• Трактовать современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.

Уметь:

• Проводить алгоритм репликации вирусов с различными типами взаимодействия их с живыми системами.

• Оценить цветную пробу Солка, реакцию гемагглютинации и гемадсорбции.

• Проводить микроскопию препаратов культуры клеток с разными видами ЦПД вирусов с помощью иммерсионного микроскопа.

Теоретические вопросы:

1. Общая характеристика вирусов, их основные свойства.

2. Морфология и ультраструктура вириона.

3. Классификация вирусов. Принципы, положенные в основу.

4. Методы культивирование вирусов.

5. Методы индикации и идентификации вирусов (характер ЦПД в культуре ткани, реакция гемадсорбции и гемагглютинации и др.)

6. Современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Микроскопия интактных пробирочных культур фибробластов и пораженных различными вирусами клеток.

2. Овоскопия куриных эмбрионов.

3. Зарисовка демонстрационных препаратов с ЦПД вирусов в протокол занятия.

4.Оформление протокола.

Литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Под ред. А.А. Воробьёва.– М.: МИА, 2004.– 691с.: ил.

2. Букринская А.Г. Вирусология.– М.: Медицина, 1986.– 336 с.: ил.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, иммунология и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, Санкт-Петербург «Специальная литература», 1998. - 592с.

4. Тимаков В.Д., ЛевашевВ.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.-2-е изд., перераб. и доп.-М.:Медицина, 1983,- 512с.

5. Пяткин К.Д. Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией.- Киев: Вища школа, 1992.- 431с.

6. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.- 768с.

7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, иммунологии и вирусологии. /Под ред. М.П. Зыкова.- М.: «Медицина», 1977.– 288 с.

8. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельскан Н.А. Микробиология. /Под ред. Ф.К. Черкес.– М.: Медицина, 1986.– 512 с.

9. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Макияров К.А. Микробиология, вирусология и иммунология. Алма-Ата: «Казахстан», 1974.– 372 с.

2. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с.

3. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559 с.

4. Павлович С.А. Медицинская микробиология в графах: Учеб. пособие для мед. ин-тов.– Мн.: Выш. шк., 1986.– 255 с.