I. Первичный гемостаз

ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ

Для исключения псевдо-тромбоцитопении необходимо повторить подсчет тромбоцитов в крови, стабилизированной цитратом натрия или гепарином и в мазке периферической крови (EDTA может провоцировать агрегацию и приводить к занижению результата подсчета в >10% случаев).

Нормальное количество: 170-350х10⁹/л.

ВРЕМЯ КРОВОТЕЧЕНИЯ (ВК)

Цель. Общая оценка адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов.

Предполагается, что изолированное увеличение ВК обусловлено тяжелыми нарушениями адгезивно-агрегационной функции тромбоци­тов (например, болезнь Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, болезнь Виллебранда).

При коагулопатиях должно оставаться нормальным.

Принцип: определяют время кровотечения из поверхностных поперечных насечек кожи на ладонной поверхности верхней части предплечья на фоне венозного стаза (на плечо накладывается манжета монометра, - 40 мм рт. ст.) (Метод Айви).

Результат. Учитывают ВК в минутах.

Референтные пределы: 5-8 мин.

Существует множество модификаций метода, создаваемых с целью повышения его стандартизации и воспроизводимости. Например, метод А.С. Шитиковой — прокалывается кожа концевой фаланги пальца. Палец погружают в емкость с определенным объемом воды определенной температуры, — учитывают нетолько время кровотечения, но и объем вытекшей крови (фотометрически).

ТЕСТ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

Цель. Оценка агрегационной функции тромбоцитов.

Принцип. Ход агрегации тромбоцитов моделируется с помощью агрегометра.

Тромбоциты стимулируются добавлением к содержащей их плазме экзогенных веществ (аденозин дифосфата, адреналина, арахидоновой кислоты, коллагена, тромбина, ристомицина), аналогичных эндогенным факторам участвующих в определенных механизмах функционирования тромбоцитов. Активация (изменение формы) и агрегация тромбоцитов приводят к изменению оптической плотности (прозрачности) исследуемой плазмы, что непрерывно регистрируется по изменению характеристик света проходящего через исследуемую плазму.

Результат выражается в виде кривой отражающей динамику ответа тромбоцитов на стимулы.

В норме после воздействия агонистов на агрегатограмме отображаются две волны агрегации: первая под влиянием введенного в плазму извне стимулятора, вторая - за счет реакции высвобождения собственных агонистов, содержащихся в гранулах тромбоцитов.

II. Вторичный гемостаз

Для оценки функционирования коагуляции и фибринолиза используются тесты, основанные на нескольких основных принципах:

1. Клоттинговые тесты – определение клоттингового времени (времени образования сгустка). Используются для выполнения скрининговых тестов, определения активности отдельных факторов коагуляции и наличия ингибиторов.

2. Хромогенные (амидолитические) тесты– фотометрическое определение активности по степени расщепления хромогенных субстратов. Синтетичес­кие хромогенные пептиды имеют последовательность аминокис­лот, аналогичную участкам естественных субстратов, расщепля­емых тромбином, плазмином и другими ферментами участвующими в гемостазе. Отщепление от хромогенного субстрата окрашиваю­щего фрагмента, обычно п-нитроанилина (pNa), позволяет по сте­пени появляющейся окраски исследуемой среды определить активность действую­щего фермента. Энзиматическое расщепление субстратов определяется с помощью спектрофотометрии. Величина изменения поглощения прямо пропорциональна концентрации фермента. Таким образом, хромогенные субстра­ты позволяют проводить прямые измерения биологической ак­тивности энзимов. Хромогенные методы характеризуются простотой выполнения, высокой точностью, воспроизводимостью результатов, возможностью кинетических измерений и автома­тизации. Используются для тех же целей, что и клоттинговые тесты.

3. Иммунологические тесты (в том числе с использованием моноклональных антител) (радиальная иммунодиффузия, электроиммунодиффузия, латексная агглютинация, ферментный иммуносорбентный метод [ELISA = Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay], радиоиммунологический анализ [RIA = radioimmunoassay]). Используются для определения наличия и концентрации различных высокоспецифичных дериватов коагуляции и фибринолиза.

4. Дополнительно используются методы для специфических исследований (например, растворение сгустка эуглобулинов для оценки общего функционирования плазминовой системы).

5. Для диагностики наследственных нарушений гемостаза используются методы молекулярной биологии. Предметом молекулярно-генетических исследований является выяв­ление мутаций генов отвечающих за продукцию белков участвующих в гемостазе.

АКТИВИРОВАННОЕ ПАРЦИАЛЬНОЕ ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ (АПТВ)

Цель. Оценка функционирования внутреннего пути коагуляции.

Уменьшение АПТВ отражает значительный дефицит или наличие в крови ингибиторов факторов внутреннего и общего путей коагуляции (за исключением XIII).

Тест используется для контроля терапии прямыми антикоагулянтами (гепаринами).

Принцип. Определяется время образования сгустка в рекальцифицированной (цитратной) бедной тромбоцитами плазме от момента добавления Ca²⁺ в условиях стандартной контактной (предварительное добавление каолина) и стандартной фосфолипидной (предварительное добавление кефалина, аналога фосфолипидов клеточных мембран) активации.

Результат учитывают и выражают в секундах. Сравнивают время образования сгустка в нормальной контрольной (референтной) и исследуемой плазме.

Референтные пределы: зависят от применяемых реактивов. В среднем <35 с.

ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ (ПВ)

Цель. Оценка функционирования внешнего пути коагуляции.

Уменьшение ПВ отражает дефицит или наличие в крови ингибиторов факторов внешнего и общего путей коагуляции.

Тест используется для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами.

Принцип. Определяется время образования сгустка в рекальцифицированной (цитратной) бедной тромбоцитами плазме от момента добавления избытка Ca²⁺ в условиях стандартной внешней активации (предварительное добавление тканевого тромбопластина определенной активности и чувствительности [рекомбинантный тромбопластин человека; вещество мозга и др. ткани человека; кролика; быка]).

Результат учитывают в секундах.

Существует несколько вариантов выражения результатов теста ПВ.

Совместным решением Международного Комитета по Стандартиза­ции в Гематологии и Международным Комитетом по Тромбозам и Гемостазу в 1985 году было предложено выражать результаты теста ПВ в виде международного нормализованного отношения (MHO) [International Normalized Ratio (INR)]. Это позволяет стандартизовать результаты теста ПВ, делает их независимыми от качеств используемого тромбопластина.

Определяют протромбиновое отношение (ПО) – отношение ПВ больного к ПВ нормальной контрольной плазмы.

Для различных тромбопластинов ПО в норме составляет 0,7-1,1.

Согласно международным требова­ниям тромбопластин должен быть стандартизирован фирмой-изготовителем, - на маркировке или в спецификации должен быть указан международный индекс чувствительности (МИЧ) [International Sensitivity Index (ISI)].

Для учета МИЧ (ISI) тромбопластина, ПО возводят в степень величины МИЧ (ISI) и таким образом рассчитывают МHO (INR).

МНО (INR) = (ПВ больного / ПВ контрольной нормальной плазмы)^МИЧ

Референтные пределы: в норме МНО близко к 1,0, и меньше 1,4.

При назначении непрямых антикоагулянтов MHO поддерживают на различном уровне, в зависимости от клинической ситуации. Чем выше MHO, тем значительнее достигнутая гипокоагуляция. (см. табл.).

В случаях, когда МИЧ тромбопластина не указан, допустимо результат теста ПВ выражать в процентах (по Квику [A.J.Quick]) - используется калибровочная кривая, построенная по результатам измерения ПВ в разведениях нормальной контрольной плазмы. Референтные пределы: 80-100% (для взрослых).

Методика расчета протромбинового индекса (ПИ) по формуле: ПИ, % = (ПВ нормальной контрольной плазмы / ПВ больного) х 100 не соответ­ствует современным требованиям - маскирует чувствительность используемого тромбопластина. Кроме того, ПИ, рассчитанный по арифметической пропорции, значительно искажает результаты исследований, поскольку в клоттинговых тестах между временем образования сгустка и концентрацией факторов свертывания имеется не арифметическая, а логарифмическая зависимость. Процентные величины, получаемые при определении по калибровочной кривой, совершенно не соот­ветствуют тем, какие определяются по пропорции (ПИ): они в 1,5—2 раза ниже.

Таблица

Рекомендуемые допустимые пределы MHO для пациентов, получающих непрямые антикоагулянты:

Профилактика и лечение:
	тромбозов глубоких вен	2.0 - 3.0
	тромбозов магистральных вен, тромбоэмболии в бассейне легочной артерии (ТЭЛА)	2.5 - 3.5
	артериальной тромбоэмболии	3.0 - 4.5
Профилактика системной тромбоэмболии:
	фибриляция предсердий	2.0 - 3.0
	искусственные клапаны сердца	2.5 - 3.5

ТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ (ТВ)

Цель. Оценка функционирования финала коагуляции - определение скорости реакции тромбин-фибриноген.

Уменьшение ТВ отражает:

- либо нарушение функционирования тромбина, например, повышенное содержание в плазме ингибиторов тромбина (прямые антикоагулянты);

- либо нарушение сборки фибрина (гипофибриногенемия; наследственная или приобретенная дисфибриногенемия [молекулярные дефекты фибриногена]; присутствие в большом количестве веществ нарушающих полимеризацию фибрин-мономеров [продукты деградации фибриногена/фибрина, парапротеин]).

Тест используется для контроля фибринолитической терапии (при назначении тАП, стрептокиназы и др).

Принцип. Определяется время образования сгустка в рекальцифицированной (цитратной) бедной тромбоцитами плазме от момента добавления тромбина определенной активности - скорость превращения фибрино­гена в фибрин.

Результат учитывают и выражают в секундах, сравни­вают время свертывания в контрольной нормальной (референтной) и исследуемой плазме.

Референтные пределы: время контроля ± 2 с, когда контроль 9-13 с; ± 5 с, когда контроль 15-20 с.

ВРЕМЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ (ВС)

Цель. Общая оценка функционирования каскада коагуляции.

ВС выявляет только наиболее грубые (тяжелые) нарушения коагуляции. По чувствительности намного уступает современным стандартизированным методикам исследования гемокоагуляции (в частности АПТВ).

Увеличение ВС происходит только при тяжелом/выраженном дефиците одного или несколь­ких плазменных факторов коагуляции либо при избытке в крови антикоагулянтов (гепарина и др.). Например, при гемофилии, при уровне VIII, IX выше 4% нормы ВС становится, как правило, нормальным.

Позволяет выявить только кратковременную ги­перкоагуляцию в дебюте ДВС-синдрома (немедленное свертывание крови в игле либо на протяжении 1 минуты в пробирке), и затем - длительный период гипокоагуляции, вплоть до наступления полной несвертываемости крови.

Тест ВС не пригоден для выявления дефицита плазменных факторов свертывания (лег­ких форм гемофилии) и для контроля антикоагулянтной, замести­тельной терапии, предоперационной подготовки больных.

Принцип. По методике Ли-Уайта (R.J.Lee, P.D.White) определяется время от момента появления венозной крови из пункционной иглы до момента прекращения перемещения крови в пробирке при ее наклоне. Тест выполняется параллельно в 2 чистых сухих пробирках одинакового размера при температуре +37°С с поправкой на турбулентное движение крови (периодически, каждые 30 с, наклоняют первую пробирку, при этом вторую оставляют неподвижной до регистрации свертывания крови в первой). В оригинале определение производится в 3 пробирках.

Результат выражают в минутах. Референтные пределы: в 1 пробирке - 5-10 мин, во 2 пробирке - 8-12 мин.

Нормальный суммирующий показатель - 8-12 мин.

Существует множество еще менее стандартизированных вариантов методики, точность и воспроизводимость результатов которых еще ниже.

ТЕСТ СМЕШИВАНИЯ

Цель. Определение характера нарушения функционирования белковых коагуляционных факторов выявленного скрининговыми коагуляционными тестами ПВ и АПТВ [дефицит / функциональная недостаточность « иммунная ингибиция].

Принцип. Смешивают в эквивалентных количествах (1:1) образцы исследуемой и нормальной контрольной (референтной) плазмы (50% уровень плазменных факторов коагуляции обеспечивает нормальные результаты скрининговых тестов). Повторно выполняют скрининговый клоттинговые тесты (ПВ и/или АПТВ), в которых время образования сгустка превысило нормальные величины. Тесты выполняются сразу после смешивания и после двухчасовой инкубации смеси, временного интервала позволяющего антителам к факторам/кофакторам коагуляции, наличие которых предполагается в исследуемой плазме, вступить во взаимодействие с коагуляционными факторами донорской плазмы и ингибировать их. В тех же условиях для контроля раз­дельно инкубируются нормальная и исследуемая плазмы, кото­рые смешиваются только непосредственно перед выполнением тестов. Результаты учитываются по различию между временем коагуляции инкубированной смеси и временем коагуляции смеси, не подвергнутой инкубации.

Отсутствие коррекции времени образования сгустка (или даже его увеличение) в смеси плазм, свидетельствует о присутствии в ней иммунного ингибитора (-ов), а не о дефиците/функциональной недостаточности плазменных факторов, при которых происходит нормализация показателей теста.

Существует несколько критериев оценки результатов. По одному из них коррекция осуществлена, если время образования сгустка в смеси плазм ниже или соответствует верх­ней границе нормальных значений + 5 секунд.

РЕПТИЛАЗНОЕ ВРЕМЯ (тест с ядом щитомордника обыкновенного).

Рептилаза - препарат содержащий очищенную гемокоагулирующую фракцию яда щитомордника.

Цель. Определение механизма нарушения функционирования реакции тромбин®фибрин: ингибирование тромбина (гепаринемия) или нарушение полимеризации фибрин-мономеров (дисфибриногенемия, высокий уровень ПДФ/Фг, высокий уровень парапротеина при моноклональных гаммапатиях).

Принцип. Яд щитомордника вызывает коагуляцию фибриногена без участия других факторов коагуляции.

Коагулирующий эффект яда щитоморд­ника не блокируется комплексом АТ III-гепарин.

Результат выражают в секундах. Сравни­вают время свертывания нормальной контрольной и исследуемой плазмы. Референтные пределы 18-22 с.

Увеличение времени образования сгустка более, чем на 3 сек свидетельствует о дисфибриногенемии (при условии, что содержание фибриногена в испытываемой плазме находится в пределах нормальных величин).

ВРЕМЯ ЛизисА фибринового сгустка в 5М мочевине (или в 1% монохлоруксусной кислоте).

Цель. Определение дефицита фактора XIII.

Принцип основан на способности 5М мочевины (или 1% монохлоруксусной кислоты) растворять сгусток фибрина не стабилизированного фактором XIII.

Результат выражают в секундах. При концентрации фактора XIII <2% лизис сгустка в мочевине происходит за 10-90 мин., в монохлоруксусной кислоте - за 4-14 мин.

Тест нечувствителен при легком дефиците фактора XIII, когда его уровень превышает 2%.

КОЛИЧЕСТВО ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ

Наиболее достоверный – хронометрический метод (по Клауссу).

Принцип основан на определении времени свертывания разведенной цитратной плазмы избытком высокоактивного тромбина. Время свертывания при этом зависит от концентрации фибриногена в плазме. Величину концентрации фибриногена определяют по калибровочному графику.

Результат выражают в г/л.

В норме количество фибриногена в плазме – 2,0-4,0 г/л.

Компоненты плазминовой системы фиксируются в тромбах, где идет интенсивное расщепление фибрина.

Уровень компонентов плазминовой системы в плазме более или менее значительно снижается при массивном тромбообразовании (синдром ДВС, массивные тромбозы) вследствие интенсивной убыли в тромбы и ускорения метаболизма.

Снижение уровня компонентов плазминовой системы также возникает при ее экзогенной активации фибринолитиками (стрептокиназа, урокиназа, ткане­вой активатор плазминогена и др.).

Ристомицин-кофакторная активность плазмы (РКАП)

Цель: определение функциональной активности фактора Виллебранда (ФВ).

Принцип основан на способности ристомицина стимулировать ФВ-зависимую агглютинацию тромбоцитов.

Функциональная активность ФВ оценивается по уровню ристомицин-кофакторной активности плазмы пациента. Определяется способность плазменного ФВ обеспечивать агглютинацию стандартных стабилизированных и суспензированных нормальных тест-тромбоцитов в присутствии ристомицина, оценивается либо темп, либо степень агглютинации по изменению оптической плотности пробы.

Время лизиса сгустка эуглобулинов

Цель. Оценка общего функционирования плазминовой системы.

Принцип. Определение уровня компонентов плазминовой системы.

Осаждают эуглобулины исследуемой рекальцифицированной (цитратной) обедненной тромбоцитами плазмы. При этом ос­новные ингибиторы плазмина, в частности a₂-антиплазмин, остаются в надосадочной части и удаляются.

Спонтанный лизис - определяют время полного растворения сгустка от момента добавления избытка хлорида Са²⁺.

Недостаток теста спонтанного лизиса - низкая опера­тивность (регистрируется на протяжении нескольких часов).

Уменьшение времени выполнения теста до минут достигается активацией плазминогена in vitro: определяют время лизиса сгустка эуглобулинов в условиях стандартной внешней активации плазминогена (предварительное добавление стрептокиназы), либо в условиях стандартной внутренней активации плазминогена (предварительное добавление каолина) (ХIIa-зависимый лизис).

Увеличение времени лизиса сгустка эуглобулинов косвенно отражает дефицит (истощение) плазминогена в плазме.

Уменьшение времени спонтанного лизиса сгустка эуглобулинов - повышенная эндогенная (рак/травмирование во время операции предстательной железы) или экзогенная (терапия фибринолитиками, например, при введении стрептокиназы, урокиназы или тАП) активация плазминовой системы.

Ошибочные результаты возможны при гипофибриногенемии (время лизиса уменьшается), при гиперфибриногенемии (время лизиса удлиняется), нарушении полимеризации фибрин-мономеров при избытке ПДФ/Фг и в присутствии ингибиторов тромбина (гепаринемия).

Увеличение времени XIIa-зависимого лизиса может происходить при снижении уровня или присутствии ингибиторов (в т.ч. ПДФ) фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена (ВМК).

Об уровне a₂-антиплазмина судят по тормозящему действию на эуглобулиновый лизис сыворотки больного. Раздельно определяют время лизиса эуглобулинового сгустка в двух пробах, в одну из которых добавляют изотонический раствор хлорида натрия, а в другую - исследуемую сыворотку.

Уменьшение времени лизиса во второй пробе свидетельствует о дефиците a₂-антиплазмина.

Точное определение уровня плазминогена и его активаторов, ингибиторов плазмина в плазме осуществляется с помощью хромогенных и иммунологических тестов.

Тесты (маркеры), позволяющие выявить глобальную активацию коагуляции и/или фибринолиза. Их выполнение целесообразно при подозрении на массивную внутрисосудистую коагуляцию (синдром ДВС, тромбозы магистральных вен, тромбоэмболия легочной артерии).
Фибринопептид А	свидетельство тромбинемии
Паракоагуляционные тесты	стигматы высокого темпа фибриногенеза и фибринолиза/фибриногенолиза
Продукты деградации фибрина	маркеры глобальной активации вторичного гемостаза (коагуляции и фибринолиза/фибриногенолиза)
Д-димеры	интенсивный лизис фибрина

ФИБРИНОПЕПТИД А (ФПА)

Иммунологические методы.

Цель. Регистрация высокого уровня тромбинемии.

Принцип. Фибринопептиды А, отщепляемые от молекул фибриногена тромбином, побочные продукты фибриногенеза. Их уровень в плазме >3 нг/мл косвенное свидетельство значительной тромбинемии.

ПАРАКОАГУЛЯЦИОННЫЕ ТЕСТЫ (ПТ)

Цель. Оценка темпа фибриногенеза (и, косвенно, фибринолиза / фибриногенолиза).

Принцип. При активном фибриногенезе (тромбинемии) в крови циркулирует повышенное количество фибрин-мономеров и олигомеров, а также их комплексы с фибриногеном и ранними продуктами фибринолиза/фибриногенолиза (ПДФ/Фг), фрагментами X и Y - растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК).

Повышенное количество РФМК в плазме маркер массивного фибриногенеза (косвенно - тромбинемии) – массивной внутрисосудистой коагуляции (синдром ДВС, инфаркт миокарда, инсульт, тромбозы магистральных вен, тромбоэмболия легочной артерии).

Отрицательный результат ПТ не исключает диагноз ДВС!

При гипофибриногенемии <1,0 г/л (фибриногенолиз при ДВС), результат ПТ, как правило, отрицательный, при значительной гиперфибриногенемии (>6,0 г/л) - ложноположительный.

При первичном фибринолизе результат ПТ отрицательный.

Протаминсульфат связывается с гепарином, что приводит ложноотрицательному результату.

- Традиционно ис­пользуемые паракоагуляционные тесты - проба с b-нафтолом в 50% спирте ("проба на фибриноген В"), этаноловый тест (ЭТ) и протаминсульфатный тест (ПСТ) имеют низкую чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Малоинформативны из-за качественной оценки ре­зультатов. Считаются устаревшими.

- Фенантролиновый тест (ФТ) отличается других паракоагуляционных тестов возможностью количественно оценивать концентра­цию РФМК в плазме. Обладает высокой чувствительностью. Результат учитывается в мкг/мл. В норме уровень РФМК в плазме составляет 33,8±0,2 мкг/мл, с пределами нормальных колебаний (± 1,5s) 27,2-40,3 мкг/мл.

ПРОДУКТЫ ДЕГРАДАЦИИ ФИБРИНА/ФИБРИНОГЕНА (ПДФ/Фг).

Иммунологические методы.

Цель. Оценка степени глобальной активации вторичного гемостаза (коагуляции и фибринолиза/фибриногенолиза).

Принцип. Определяется общее количество продуктов деградации (расщепления плазмином) фибрина и фибриногена (ПДФ/Фг) в плазме.

Уровень ПДФ/Фг >10 мкг/мл одно из достаточно надежных свидетельств массивной внутрисосудистой коагуляции.

На основании опреде­ления уровня лишь ПДФ/Фг невозможно дифференцировать первичный и вторичный фибринолиз, тест не позволяют отличить фрагменты фибриногена и фибрина.

D-ДИМЕРЫ

Иммунологические методы.

Цель. Регистрация интенсивного лизиса значительного количества фибрина.

Принцип основан на определении количества продуктов деятельности плазминовой системы специфичных для лизиса именно фибрина. Конечными продуктами расщепления фибриногена являются мономеры - фрагменты D и Е. При расщеплении перекрестно-сшитого фибрина (стабилизированного фактором XIII) образуются фрагменты, содержащие ковалентно связанные домены D смежных фибрин-мономеров (D-димеры).

Уровень D-димера >500 нг/мл одно из наиболее надежных свидетельств массивной внутрисосудистой коагуляции (синдром ДВС, тромбозы магистральных вен, тромбоэмболия легочной артерии).

ОСМОТР МАЗКА ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ необходим для исключения псевдотромбоцитопении, оценки морфологии тромбоцитов и эритроцитов.

Обнаружение фрагментированных эритроцитов (шизоцитов) в большом количестве – свидетельство внутрисосудистой коагуляции.

ИССЛЕДОВАНИЕ КОСТНОГО МОЗГА используется, прежде всего, чтобы оценить продукцию тромбоцитов.

После определения нарушения функционирования определенного компонента гемостаза (групповые, скрининговые тесты) и установления характера нарушения функционирования (тест смешивания, рептилазное время) выполняется либо пошаговое определение дефицита определенного фактора коагуляции, либо определяется наличие и количество определенного ингибитора.

При выборе дальнейших тестов, позволяющих определить нарушения функционирования отдельных элементов гемостаза необходимо также руководствоваться статистической вероятностью существования того или иного дефекта гемостаза.

Определение дефицита отдельных факторов также целесообразно при нормальных показателях скрининговых тестов, но наличии анамнестичесих и/или клинических свидетельств геморрагического диатеза.

Диагностический алгоритм

геморрагический синдром / предполагается ГЕМОРРАГИЧЕСКИЙ ДИАТЕЗ: