Изучение микробиологических свойств зуб­ных паст

Состоит из определения влияния предлагаемых зубных паст на физиологическую собственную микрофлору полости рта, изучения возможности микробного обсеменения зубных паст при их хра­нении и в процессе использования (см. Испытания паст зубных микробиологические) и подтверждения того, что разработанная паста зубная не является питательной средой для развития патологической микрофлоры.

А) Определение воздействия зубных паст на фи­зиологическую аутофлору полости рта эксперимен­тальных животных

Для данных исследований используют белых лабо­раторных крыс. После 10-дневного карантина жи­вотных группируют по 10-15 особей в соответствии с задачами эксперимента. Оптимальное количес­тво групп животных:

I группа — чистый контроль (не применяют никаких манипуляций и средств),

II группа — контроль (чистка зубов щеткой или ват­ным тампоном без использования лекарственных средств),

III группа — контроль (использование пла­цебо-средства),

IV группа — опытная.

Возможно со­кращение количества контрольных групп до 2. Бактериологический материал со слизистой обо­лочки полости рта (спинка языка, щека, твердое небо) забирают стерильными дисками из филь­тровальной бумаги (диаметр 3,0-3,25 мм) утром до кормления животных. Зубоврачебным пинцетом диск плотно фиксируют до полного смачивания ро­товой жидкостью (приблизительно 4,0-5,0 с). Зубной налет снимают с помощью зубоврачебного эк­скаватора до наполнения вогнутой рабочей части инс­трумента. Бактериологический материал, собранный бумажными дисками, и зубной налет тщательно гомо­генизируют: диски растирают в фарфоровых ступах с небольшим количеством физиологического раствора и помещают в стерильные пробирки с 5 мл физиологи­ческого раствора; зубной налет в 5 мл физиологичес­кого раствора суспендируют в аппарате для встряхива­ния биологических жидкостей. Бактериальные суспен­зии по 0,1 мл высевают на твердые дифференциально-диагностические питательные среды и распределяют по поверхности среды стеклянным шпателем. В качестве дифференциально-диагностических сред используют агар с 5% дефибринированной кро­вью кролика, желточно-солевую среду по Чистовичу, среды Эндо, Сабуро, томатно-молочный агар и M.S.A. «Difco».

Посевы на M.S.A. «Difco» и томатно-молочном агаре инкубируют при 37°С от 48 до 72 часов в анаэроб­ных условиях, на агаре с кровью, желточно-солевым и Эндо — 24 часа в аэробных условиях. На агаре Сабуро посевы инкубируют до 5 суток при 22-24°С. Проводят подсчет колоний и предварительную иден­тификацию полученных штаммов микроорганизмов по культуральным и морфологическим признакам. Для специальных исследований выделяют чистые штаммы микроорганизмов и проводят дальнейшее изучение качественной характеристики микробных видов.

Наблюдения за возможными изменениями коли­чественного и качественного состава аутофлоры полости рта крыс проводят в динамике: до нача­ла эксперимента (фоновые данные), через 2, 4, 6 и 9 недель.

Общие количественные сдвиги физиологической микробной флоры полости рта животных опытных групп, по сравнению о контрольными, не должны превышать абсолютного числа на 10-15 колоний микроорганизмов. Появление в посевах микроор­ганизмов, не свойственных здоровой полости рта экспериментальных крыс, таких как золотистый стафилококк с патогенными свойствами, протей и кишечная палочка, является показателем нежела­тельного воздействия изучаемой зубной пасты на аутофлору полости рта.

Б) Изучение сохранения жизнеспособности бакте­рий в зубных пастах при хранении Зубные пасты на протяжении 2 лет после выпуска не должны содержать патогенных микроорганиз­мов и не являться питательной средой для жизне­деятельности бактерий, которые смогут проникнуть в пасты в процессе использования.

Для данного исследования целесообразно приме­нять следующие контрольные штаммы микроор­ганизмов: Staph, aureus 209, E.coli M-17, Candida albicans, Str. viridans N 1, Вас. subtillis N 720. Отдельные виды микроорганизмов в виде суспен­зии суточной культуры вносят бактериальной петлей в тубу (после предварительного частичного выдав­ливания). После этого тубы инкубируют при 37°С, за­тем содержимое выдавливают в чашку Петри, откуда материал забирают бактериальной петлей и делают посев в соответствующие питательные среды. Результаты расценивают как положительные при полном отсутствии микробного роста.

Исследование эффективности и механизма дей­ствия профилактических и лечебных зубных паст. Для создания высокоэффективных паст, обладаю­щих профилактическими и лечебными свойствами, важно изучить механизм их действия, специфичес­кую (лечебную и профилактическую) активность в конкретной композиции зубной пасты. Такие дан­ные позволяют своевременно корректировать ком­позицию зубной пасты и добиться максимальной ее эффективности.

А) Изучение противокариозной эффективности. Ее определяют в экспериментах на животных (бе­лых крысах линии Вистар) с первоначальной мас­сой 40-50 г. Выбор этих животных, общепринятый в современной стоматологии, обусловлен тем, что модель экспериментального кариеса у них легко воспроизводится.

Алиментарную модель воспроизводят кариесогенным рационом Стефана 580, содержащим избыток углеводов.

Кариеспрофилактическую эффективность новой зуб­ной пасты следует сравнить с известными (одним или двумя) аналогами. Для этих целей формируют мини­мум 2-3 опытных и 1-2 контрольные группы (в одной контрольной группе не применяют пасты — чистый контроль, во второй — используют плацебо). Исполь­зуют не менее 30 животных в каждой группе. О про­тивокариозной эффективности испытываемой пасты судят по разнице в интенсивности развития кариеса зубов животных опытной и контрольных групп за оп­ределенный период времени.

Методика эксперимента: крысу кладут на пред­метный столик спинкой вниз, фиксируют передние и задние лапки, а также голову мягкими резиновыми кольцами. Фиксацию головы проводят путем захвата резцов верхней челюсти. Рот свободно открывается с помощью другого резинового кольца, накинутого на нижние резцы животного. Далее эксперимента­тор с помощью гладилки или другого подходящего инструмента отодвигает щеку и необходимые ма­нипуляции проводит на верхней, а затем на нижней челюсти.

Зубные пасты наносят на зубы экспериментального животного специально изготовленной зубной щет­кой или кисточкой из мягкого волоса. Длительность процедуры — 1-2 минуты. Животные сравнительно легко переносят процедуру чистки. Особей, кото­рые ведут себя во время манипуляций агрессивно, следует исключить из опыта; к наркозу прибегать нежелательно.

Манипуляции по нанесению разработанных паст и плацебо-средств проводят обычно 1 раз в день, ежедневно в течение 4 или 6 недель, в зависимости от методики оценки кариозного индекса. При спе­циальных целях эксперимента (отработка дозы, ме­тодики и др.) перечисленные параметры могут быть изменены.

По окончании эксперимента крыс усыпляют эфиром или хлороформом и декапитируют, челюсти вычле­няют и фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 часов. После этого челюст­ные блоки промывают водой, очищают от мягких тканей, а зубы — от остатков пищи, отсекают резцы и дистальные участки челюстей. Кариозные поражения зубов определяют визуально (невооруженным глазом, с помощью лупы или микро­скопа), оценивают количество и размер видимых кариозных полостей. Ранние стадии кариеса, ко­торые развиваются у животных примерно через 2-3 недели содержания их на кариесогенном рационе, более точно позволяет выявить серебрение. Для этого подготовленные блоки челюстей крыс импрегнируют в течение 5-6 часов 1 -2% раствором азотнокислого серебра. Затем челюсти промывают дистиллированной водой (меняя ее несколько раз) в течение 1-2 часов и высушивают. Из квадрантов челюстей готовят полушлифы, разрезая блок на симметричные половины по продольной оси зубов или сошлифовывая до срединной плоскости, проходящей через центры всех моляров. Для сошлифовывания используют мелкозернистую наждачную бумагу, последующую полировку проводят на толстом стекле или бумаге. Полученные односторонние шлифы квадрантов челюстей с тремя молярами помещают в чашки Петри, на дно которых предварительно наносят слой пластилина, и изучают их с помощью стереоскопического микроскопа МБС-1 или МБС-2 при различных увеличениях. Активность кариозного процесса (индекс глубины гипо- и деминерализации) оценивают по степени проникновения азотнокислого серебра в твердые ткани зубов по 5-балльной системе:

1 балл — проникновение азотнокислого серебра в эмаль не глубже ее середины;

2 балла — проникновение до эмалево-дентинного К соединения;

3 балла — проникновение за пределы эмалево-дентинного соединения, но не более 1/3 толщины дентина;

4 балла — полное прокрашивание эмали и окраска дентина более 1/3, но менее 2/3 его толщины;

5 баллов — проникновение азотнокислого сереб­ра через всю толщину эмали и дентина до полости зуба.

Поскольку кариес зубов локализуется преимущест­венно в фиссурах и в контактных зонах, то во избе­жание диагностических ошибок для оценки интен­сивности кариеса используются только эти участки (при оценке первого и второго моляров таких участ­ков— 8, а при учете всех трех моляров каждого квад­ранта — 10). Индексы глубины гипоминерализации эмали и дентина (определенные, как указано выше) заносят на перфокарту, рассчитывают индекс пораженности отдельных пунктов, на основании чего определяют индекс кариозности зубов (ИК) верх­них и нижних челюстей или всех моляров крыс. За­тем сравнивают статистические показатели каждой группы животных и вычисляют противокариозную эффективность исследуемых зубных паст. Послед­нюю оценивают по величине редукции индекса ка­риозности (РИК), которая выражается в процентах (%) и рассчитывается следующим образом:

РИК= ИК_К.ГР.- ИК_ОП.ГР. /И_КК.ГР.

где:

РИК— редукция индекса кариозности;

ИК_К.ГР — индекс кариозности контрольной группы;

ИК_ОП.ГР — индекс кариозности опытной группы.

Полученные результаты оценки противокариозного эффекта сравнивают с использованием статисти­ческих методов анализа, например, метода Стьюдента. Целесообразным считают дальнейшее изу­чение средств, дающих в эксперименте редукцию индекса кариозности не меньше 20%.

Б). Изучение влияния зубных паст и их активных ком­понентов на проницаемость твердых тканей зуба Установлено, что многие химические и физические факторы влияют на проницаемость эмали, увели­чивая или уменьшая ее для компонентов ротовой жидкости, С физиологической точки зрения, как увеличение проницаемости, так и ее уменьшение являются нарушением установившегося во рту ин­дивидуума уровня физико-химических реакций среды: поверхность зуба — слюна. Проницаемость эмали может быть изменена введе­нием в изученную пасту компонентов, повышающих или понижающих проницаемость эмали и ее спо­собность к реминерализации. Поэтому важно знать, в какой степени испытуемая паста влияет на прони­цаемость эмали, особенно для ионов минеральных веществ, которые обеспечивают минерализацию твердых тканей зуба.

Опыты проводят на собаках 1-3-летнего возраста. Сразу или на следующий день после завершения обработки зубов испытуемым средством (в режиме, возможно более близком к условиям его клинического применения) изучают проницаемость зубных тканей для меченных радиоактивными элементами веществ путем аппликации их раствора на поверхность эма­ли. Для этих целей используют меченные ⁴⁵Са мине­ральные вещества (например, ⁴⁵CaCI₂) или меченные ¹⁴С органические вещества (например, лизин — 1 ¹⁴С или глицин - 2 ¹⁴С и др.). Контролем служат одно­именные зубы противоположной стороны челюсти, которые обрабатывают контрольным средством.

Определение степени проницаемости эмали и конт­рольных зубов проводят методом макроавторадиографии с последующей денситометрией в моди­фикации, описанной А.Г. Колесником и П.А. Леусом (1974).

Изучение уровня проницаемости эмали является обязательным критерием при оценке кариесстатического действия средств гигиены полости рта и профилактики кариеса зубов.

В) Определение перехода активных компонентов зубных паст в ротовую жидкость и ткани полости рта. При разработке и испытании той или иной рецепту­ры новой зубной пасты необходимо выяснить сте­пень и динамику перехода активных компонентов зубных паст в ротовую жидкость и поверхностный слой эмали или слизистую оболочку полости рта и пародонт. При этом исследовании важно опреде­лить ротовой клиренс кальция, фосфата, фтора или других активных компонентов, поступающих в рото­вую жидкость из испытуемой зубной пасты во время чистки зубов.

■ Определение ротового клиренса. У практически здоровых лиц молодого возраста утром натощак после полоскания рта собирают в мерную пробир­ку не менее 5,0 мл слюны. Затем проводится чистка зубов испытуемой зубной пастой не менее 3 минут. После этого в течение 2 часов, каждые 15 минут, у испытуемых собирают в мерную пробирку не ме­нее 2,5 мл ротовой жидкости. В собранных пробах ротовой жидкости после ее центрифугирования или фильтрования определяют кальций, фосфор, фтор или другие активные добавки, входящие в рецепту­ру пасты. По результатам анализа строится график клиренса.

■ Кальций в ротовой жидкости определяют на атомно-абсорбционном спектрофотометре. Предваритель­но 0,1 мл центрифугата ротовой жидкости разводят в 10 раз 0,10% раствором двунатриевой соли ЭДТА (буфером).

■ Неорганические фосфаты в ротовой жидкости оп­ределяют микрометодом Chen, Toribara, Warner (1956) в модификации (Персиц М.М., Колесник А.Г., 1976). 2,5% водный раствор молибденово-кислого аммония смешивают с 1Н-раствором серной кислоты и 10% раствором аскорбиновой кислоты в соотношении 1:8:1. Реакционную массу тщатель­но перемешивают. К 10 мкл пробы фильтрата или центрифугата ротовой жидкости добавляют 3,0 мл смеси реактивов. Одновременно с пробой готовят серию стандартных растворов, содержащих 1 -5 мкг фосфора. Все пробы и стандарты инкубируют в тер­мостате при 37°С в течение 1,5 часов. Окрашенные растворы фотометрируют при длине волны 820 нм. Концентрацию фосфора в пробе рассчитывают по калибровочной кривой.

■ Фтор в ротовой жидкости определяют электро­химическим методом фтор-селективным электро­дом. Предварительно пробы ротовой жидкости так же, как стандартные растворы фтористого натрия (для калибровки электрода), разводят в соотно­шении 1:1с ацетатным буфером (рН 4,7) или дру­гим буфером, регулирующим общую ионную силу (TISAB).

Концентрацию фтора в пробах ротовой жидкости определяют по калибровочному графику, построенному на полулогарифмической бумаге или вычисля­ют по формуле:

С_р = С_ст • 10∆Е / S

где:

С_ст — концентрация фтора в стандартном растворе в районе пробы;

∆Е — разница между потенциалом стандартного раствора и потенциалом в растворе пробы;

S — крутизна характеристики электрода (электрод­ная функция фторидного электрода), равная 55-58 мВ при 10-кратном изменении концентрации фторид-иона.

■ Определение включения фтора в эмаль из зуб­ной пасты проводится на удаленных зубах, а также в клинике (in vitro или in vivo).

Пробу эмали получают кислотной биопсией по ме­тоду Hotz, Muhlemann, Schait (1970) в модификации М.М. Персица(1974). Эта методика позволяет полу­чить данные о послойном приросте концентрации фтора в поверхности эмали на глубине 5-12 мкм. Биопсию эмали проводят путем наложения на со­зданное тем или другим способом «окно» на поверх­ности эмали диска из фильтровальной бумаги, смо­ченной 5,0 мкл 0,5 М хлорной кислоты, на 20-30 се­кунд. Затем диск переносят в полиэтиленовую про­бирку, которую предварительно наполняют 1,0 мл буфера TISAB (рН 5,25) и 1,0 мл раствора фтористо­го натрия (концентрация фториона — 0,1 мг/л). Фтор в пробах деминерализата эмали определяется электрохимическим способом фтор-селективным электродом. Предварительно фтор-селективный электрод калибруется стандартными растворами фтора — 0,1 мг/л; 1,0 мг/л; 10,0 мг/л.

■ Кальций в растворе биоптата эмали определяется на атомно-абсорбционном спектрофотометре с до­бавление в пробу 0,1% буферного раствора трило-на «Б» (двунатриевой соли ЭДТА).

■ Фосфор в пробах биоптата эмали определяется микрометодом Chen, Toribara, Werner (1956). Мето­дика подробно изложена выше.

Толщину деминерализованного слоя эмали рассчи­тывают по формуле:

h=m/d•S

где:

h — толщина эмали (в см);

m — масса растворенного апатита эмали (по каль­цию) (в г);

d — удельная масса эмали, равная 2,95 г/см³;

S — площадь биопсированной поверхности эмали (в см²).

Масса эмали и содержание фтора в ней при био­псии рассчитывают, исходя из того, что содержание кальция в эмали равно 37 мас.%. При этом содержа­ние фтора в поверхностном слое эмали (в мкг/г или ppm) рассчитывают по формуле:

F=C_F•V/m

где:

C_F — концентрация F в мкг/г или р.р.м. в пробе из биоптата эмали;

V— объем пробы в мл (равный 2 мл);

m — масса растворенного апатита эмали (в г).

■ Определение уровня перехода других активных компонентов зубных паст в эмаль зуба и другие ткани полости рта: уровень перехода других (кро­ме фтора) компонентов зубных паст в эмаль зуба и другие ткани полости рта, таких как кальций, фос­фор и т.п., следует изучать методом радиоактивных индикаторов. Для этого в исследуемую пасту вводят радиоактивную метку (например, ⁴⁵Са, ³²Р или дру­гой меченый элемент) в индикаторных дозах (10-100 мкКц на 1 мл исследуемого средства гигиены полости рта), по возможности в том же молекуляр­ном составе. Затем проводят обработку зубов чело­века (in vitro) или зубов собак (in vivo) такой пастой в приближенном к клиническим условиям режиме. Собственно определение перехода меченных изо­топами компонентов зубной пасты в эмаль зуба или другие ткани полости рта можно проводить двумя методами: методом макрорадиоавтографии или послойной биопсии с последующей радиометри­ей и определением суммарного количества Са и Р в пробе. Для этого к биоптату (5 мкл 0,5 М раство­ре хлорной кислоты) добавляют 195 мкл деионизи-рованной воды, тщательно перемешивают путем встряхивания и отбирают 100 мкл смеси для радио­метрии и по 10 мкл для определения Са атомно-абсорбционным методом и неорганического Р спектрофотометрически. Радиометрию проводят на сцин-тилляционном радиометре после добавления сцинтиллятора, смешивающегося с микрообъемом вод­но-кислотной пробы (например, смесь метилцеллозольва с толуоловым РРО/РОРОР сцинтиллятором). Рассчитывают следующие показатели:

- удельную радиоактивность на мкг Са, Р или мас­сы эмали с привязкой к определенной толщине слоя эмали и его расположению — поверхност­ный, подповерхностный и более глубокие слои;

- при сопоставлении двух или более композиций зубных паст — относительный коэффициент пе­рехода по формуле:

К = УА_оп / УА_контр х 100%,

где:

УА_оп — удельная радиоактивность слоя, созданная в эмали при обработке композицией опытной зуб­ной пасты;

УА_контр — удельная радиоактивность соответствую­щего слоя, созданная в эмали при обработке конт­рольной композицией зубной пасты.

Токсикологические исследования Проводятся при разработке совершенно новой ре­цептуры зубной пасты, в случаях введения в извест­ную рецептуру нового, не имеющего токсикологи­ческой характеристики компонента, а также при из­менении количественных соотношений известных ингредиентов в пасте или при сочетании известных, но ранее в комплексе в зубных пастах не применяв­шихся. А также при проведении сертификационных испытаний.