Лейкоциттердің миграциясын тежеуші серпілісі (лмтс)

ЛМТС әр түрлі жұқпалы ауруларда, негізінен жасушаішілік бактериялармен зақымданғанда: туберкулез, бурцеллез, лепра; кандидоз және созылмалы вирусты жұқпаларда иммундық жауабын; сонымен қатар аллергиялық ауруларда аллергендерге сезімталдығын анықтау үшін табысты қолданады.

Әдістің қағидасы. Эритроциттер қоспасы жоқ қан плазмасынан алынған лейкоциттер қоспасын, (50 мкл) 199-ші ортасымен (бақылауда) және индукцияланған вариант – ФГА-мен бір көлемде араластырады. ФГА концентрациясы 1 мл-де 10 мкг.

Осы серпілістің бірнеше модификациясы бар. Иммунологиялық серпіліске арналған планшетке, дуплетке немесе триплетке 10% бұзаудың эмбриондық белсенденген сарысу қосылған 199 ортасын құяды. Мөлшері 7мм және диаметрі 1мм капиллярды ортасы бар лейкоциттер қоспасымен немесе ФГА-мен толтырады. Бір ұшын арақатынасы 1:3 тең парафин және васк қоспасымен толтырады, екінші жағын – планшеттің ұясына түсіреді. Планшетті қақпақпен жабады, 18-24 сағатқа 37°С инкубациялайды.

Капиллярды алып тастағаннан кейін сұйықтықты лункаларда қайтадан суспензиялайды. Әр лункада лейкоциттердің санын Горяев камерасымен есептейді. ФГА-мен бақылау және сынақ үшін орташа санын есептейді. Миграция индексін есептеу үшін тәжірибедегі жасушалардың концентрациясын бақылаудағы сондай концентрацияға бөледі. Қалыпты жағдайда арақатынасы 0,3-0,5 тең.

Капиллярлық әдіс. Бөлінген лейкоциттермен бір жағы ашық, ал екінші жағы жабылған 2 капиллярды толтырады. Кейін центрифугалайды және жасушалары жоқ тұнбаны алып тастайды. Содан соң бір капиллярға ынталандыруды (ФГА) қосады және 24 сағат бойы 37°С инкубациялайды. Бақылау және тәжірибе капиллярларының ашық жағынан планшеттің ұясына лейкоциттердің миграциясы жүреді. Серпілісті бақылау және тәжірибе ұяларындағы жасушалар концентрациясының арақатынасымен бағалайды. Қалыпты жағдайда арақатынасы 0,6-0,87 тең (миграция индексі).

Макрофагтардың жайылуын тежеу серпілісі (МЖТС).

Бұл серпіліс лимфокиндермен шақыралатын мононуклеарлы фагоциттердің өзгеруімен негізделген. Моноциттер және макрофагтар әйнектің бетінде жайылу қабілеті бар. Моноциттерді сенсибилизацияланған лимфоциттермен дақылдандырған кезде бұл қабілеті төмендейді.

Макрофагтардың адгезиясы тежеуші серпілісі (МАТС)

Бұл серпіліс сезімталдығы жоғары донордың, арнайы антигені бар әйнекті пластинаға мононуклеарлық фагоциттер адгезиясының тоқтауымен негізделген.

Қан сарысуында цитокиндер өнімдерінің құрамын анықтау.

Қанның моноциттерімен және лимфоциттерінің негізгі қызметі цитокиндерді өндіру және өндіру болып табылады. Цитокиндер – жасушааралық коммуникацияда және дегемопоэзде жасушалардың өсуі және дифференциялануы, иммунды хабарлы жасушалардың эффекторлық және реттегіш қызметтері сияқты бірқатар биологиялық қызметті ортақтастыратын иммундық жүйенің реттегіш нәруыздары.

Бүгінгі күнде цитокиндер деңгейін бағалауда ең тиімдісі иммунды ферменттік әдістер болып табылады. Әр түрлі патологияда жергілікті және жүйелі деңгейлерде цитокинді статусты бағалауға арналған диагностикалық иммунды ферменттік сынама-жүйелерін қолдану, аурудың патогенезінің түсініктемесінде қосымша болып табылады. Қан лимфоциттері және моноциттердің цитокиндерді өндіру (интерлейкиндер, инферондар) қабілетінің бағасын соңғы уақытта олардың функционалдық жарамдығын тексеруде жиі қолданады.

Әдістің қағидасы. Спонтанды өнімдерінің ИЛ1β, ИЛ-1-РА, ИЛ-2, ИЛ-4, ИФγ және ИФα анықтауға арналған әдістің сезімталдығы ИЛ1β үшін -6,25 пг/мл, ИЛ-1-РА үшін – 50 пг/мл, ИЛ-4 және ИЛ-2 үшін – 5пг/мл, ИФγ және ИФα үшін 15 пг/мл құрайды. Қатты фазалық иммунды ферменттік талдау әдісі қатты фазада (иммунды ферменттік талдауға арналған 96 лункалық плат) кешендердің құруымен негізделген. Ол кешендер: 1) ерітіндідегі цитокиндермен байланысты тышқанның моноклонды антиденелерінен; 2) цитокиннен; 3) цитокиндерге қоян поликлонды антиденелерінен; 4) қоян иммуноглобулиндерге ешкі антиденелері бар хрен пероксидазасының конъюгатасынан тұрады.

Платтарға керек реагнеттерді енгізген кезде кешен қалыптасады. Аспирация және платты жуу арқылы артық реагенттерді жояды. Хромоген ерітіндісі қосылғаннан кейін, әр лункада байланысқан конъюгат мөлшеріндегі боялу жиілігін анықтауда хромоген ерітіндісін әрбір лункаға қосқанда білеміз. Талдаудың нәтижесі калибрлі кесте арқылы анықталады. Ол фотометрде ИФТ-мен сәулелі фильтрдегі 492нм оптикалық тығыздықты анықтау.

IL-2. Дақылдық сұйықтықта және қан сарысуында болуын 20-дан 1000 пг/мл дейін (1 пг=10^-12г) концентрация интервалында анықталады. IL-2 митоген немесе антигенмен белсендірілген Т-лимфоциттермен өндірілетін, гликопротеин болып табылады. IL-2 иммунды жауаптың дамуында маңызды рөл атқарады. IL-2 төменгі деңгейі әр түрлі ауруларда: склерозда, склеродермияда, ревматоидтық артритте, инсулинге тәуелді диабетте, жүйелі қызыл жегі және т.б. байқалады.

IL-1-β сарысу және дақылдық сұйықтық үлгісінде 6,3-тен 400 пкг/мл дейін (ООО «Цитокин») концентрация диапозонында анықталады. IL-1β негізгі көзі моноциттер, макрофагтар және дендритті жасушалар болып табылады. IL-1α-дан айырмашылығы IL-1β ерігіш формасы түрінде кездеседі. IL-1β рекомбинантты түрінің айқын иммунды тапшылықты емдеуде және гемопоэзді қалпына келтіру кезінде клиникалық тәжірибеде қолданады.

IL-1RA (IL-1 рецепторлық антагонисті). Дені сау донордың сарысуында 350-ден 700 пг/мл дейін болады. Макрофагтармен, моноциттермен, нейтрофилдермен, фибробласттармен және эпителий жасушаларымен өндіріледі. IL-1RA IL-1α және IL-1β биологиялық белсенділігін тежеу арқылы олардың рецептормен байланысуында жарысады. Адам қанында IL-1RA концентрациясын анықтау сепсис, ревматоидтық артрит, демікпе және қабыну аурулары кезінде диагностикалық және болжамдық мағынасы бар.

IL-4 белсендірілген Т-лимфоциттермен өндіріледі. IL-4 В-лимфоциттердің, сүйек кемігіндегі ізашар жасушаларының және мес жасушаларының пролиферациясын белсендіреді. IL-4 бірқатар беткей антигендердің экспрессиясын шақырады және цитофилді иммуноглобулиндердің өнімдерін белсендіреді. Оның көптеген биологиялық қызметтері, гуморалдық иммундық жауапты реттейді. Оның көптеген биологиялық қызметтеріне, гуморалдық иммундық жауапты IgE өнімдеріне және реттейтін Т-хелпердің субпопуляциясының Th2 стимуляциясына плазмалық жасушалар түзетін иммуноглобулиндердің өнімдеріне ауысуының индукциясы жатады. IL-4 сонымен қатар айқын ісікке қарсы белсенділігіне ие болады.

IL-8 әр түрлі ынталандырушыға, эндотоксин, IL-1, TNF-α және вирустарға жауап ретінде мононуклеарлы фагоциттермен, полиморфтыядролық лейкоциттермен, эндотелий жасушалармен және әртүрлі мезотелиалды тип жасушаларымен өндіріледі. IL-8 біріншілік қызметі – қабыну жерлерінде нейтрофилдің белсенділігі және хемотаксисі. Қазіргі уақытта жарақатты емдеуде IL-8 негізіндегі препараттарды сынаудан өткізуде.

Интерферон-α вирусты жұқпалардан ағзаның арнайы емес қорғаныстың негізгі элементтерінің бірі болып табылады. Интерферон-α моноцитарлы-макрофагалды қатардағы жасушалармен түзіледі. Барлық жасушаларды қажетті тұрғыда белсендіретін болсақ, олар IFN-α өндіруі мүмкін. Бірақ IFN-α ең көп санын дендриттік жасушалардың ізашарлары өндіреді. Қалыпты жағдайда қан сарысуында альфа-интерферонның деңгейі біршама аз және ол бірнеше бірлікті құрайды: 5-50 пкг 1 мл сарысуда. IFN-α түзілуінің негізгі индукторы көптеген вирустар және олардың өнімдері, оның ішінде маңызды орын алатын екітізбектік РНК болып табылады. IFN-α биологиялық қызметі вирусты жұқпаларға және ісік өсуінің тежеуіне бағытталған. IFN-α негізіндегі препараттарды клиникалық тәжірибеде белсенді түрде қолданады.

IFN-γ Т-лимфоциттермен және табиғи киллермен өндіріледі. Макрофагтардың сонымен қатар табиғи киллердің, микробқа және ісікке қарсы in vitro және in vivo белсендігін күшейтеді. IFN-γ МНС ІІ класс молекуласының экспрессиясын белсендіреді. IFN-γ В-жасушалардың дифференциялануы және активациясының кофакторы, сонымен бірге IL-4 функционалдық антагонисті болып табылады.

TNF-α. Көптеген ынталандыруға: митогендерге, цитокиндерге, бактерияларға, вирустарға және паразиттерге жауап ретінде, макрофагтар TNF-α негізгі өндіретін жасушалар болып табылады. Ісікке қарсы белсенділігінің болуына қарамастан, TNFα иммунды жауаптың, қабынудың және гемопоэз модуляциясында маңызды рөл атқарады; ісікке қарсы иммунитетке қатысады, TNFα өнімі артық болған кезде анорексия, кахексия, септикалық шок шақырады.

Моноклонды антиденелер

1974-1975 жж. Г.Келлер және У.Мильштейн біреуі – ісіктік (миеломды жасуша), екіншісі – қалыпты лимфоциттен тұратын, біріккен екі жасушадан алынған гибридті жасушаларды алу үшін әдістеме шығарған. Алынатын гибридті жасушалар қалыпты лимфоциттер (геномы тұрақтанбағанша, хромосоманың басқа бір бөлігі алғашқы бөліну кезінде жасушалардан шығарып тасталады) хромосоманың бір бөлігі (сонымен қатар, қасиетін) және ісік жасушаларының бір бөлігі болады. Тек қана шексіз бөлінетін жасушалар өзін-өзі клондауға «рұқсат етеді», яғни физикалық түрде бір-бірлеп «жайғастырады» (әрқайсысын жеке ыдысқа) және бір жасушадан тараған ұрпақ – жасушалар клонын алады. Бұл жасушаларды – гибридомдар деп атаған. Осы жасушаларда қалыпты лимфоциттердің өнімдері, көбінесе, антиденелердің биосинтезі жүреді.

Гибридом жасушаларымен өндірілетін антиденелерді моноклонды антиденелер деп атайды. Олар жеке нәруыздарға қарсы бағытталған (қарастырылатын жағдайда лейкоциттердің жасушалық мембранасының компоненттері) және тек осы нәруыздармен байланысатын антиденелер болып табылады. Осындай антиденелер белгілермен, мысалы, арнайы Т-жасушалық нәруыздарға қарсы, тек Т-лимфоциттер ғана жарқырау қабілетіне ие болады. Осындай жасушалардың санын люминесцентті микроскоп арқылы анықтауға болады. Сондау зерттеулерді автоматизациялау үшін – жасушалардың флуоресценттік анализаторы, немесе ағымды цитофлуориметр деп аталатын арнайы құрал жасалған.

Люминесценцияны қоздыратын күн сәулесі түскен жіңішке капиллярлар арқылы жасушалар тоқтаусыз өтеді. Әрбір жарқырайтын жасуша арнайы детектор арқылы импульс ретінде тіркеледі. Құрал автоматты түрде хабарды өңдеп, гистограмма ретінде – әртүрлі жарқырау қарұындығын бар жасушалардың таралу графигінің нәтижелерін береді. Моноклонды антиденелердің көп жиынтығын пайдалана отырып, қанда Т-(CD2⁺, CD3⁺) және В-лимфоциттердің (СD19⁺, CD20⁺, CD22⁺, CD72⁺) cанын ғана емес, сонымен қатар Т-лимфоциттер субпопуляцияларының: Т-хелпердің (CD4⁺) және цитотоксикалық Т-лимфоциттердің (CD8⁺), NK – жасушалардың (CD56⁺, CD16⁺) санын анықтауға болады.

Қазіргі уақытта әр түрлі антигендерге моноклонды антиденелердің (МонАД) көптеген түрлері шығарылған (13 кесте).