Иммунды флюоресценттік сынамада жасушаларды бояу әдістері

1. Лимфоциттерді верографин (урографин) - фиколл градиентінде центирфугалаған (айналдырған) (тығыздығы 1.077 г/мл) (Воуum, 1968) гепаринденген веноздық қаннан бөліп алады;

2. Лимфоциттерді центрифугалық пробиркаға немесе 96-лункалық планшетке 50 мкл көлемде 1 мл-ге 2 млн мөлшерде енгізеді. Жасушаларға 5 мкл сынамалайтын моноклонды антиденелер ерітіндісін қосады және +4°С 30-45 мин. инкубациялайды:

3. 150 мкл Хенкс ерітіндісін қосып, 200g, 5 мин центрифугалайды;

4. Супернатантты алып тастайды. Содан соң,50 мкл Хенкс ерітіндісін енгізеді, жасушаларды суспензиялайды, 150 мкл Хенкс ерітіндісін қосып, 200g 5 мин. центрифугалайды;

5. Супернатантты алып тастайды. Жуылған жасушалардың тұнбасын тышқан Ig-не ФИТЦ белгіленген және 1:100 ерітілген қой антиденелернің 50 мкл F(аЬ)2-фрагментін қосады, Еріту үшін құрамы 0,5% желатиннен және 0,1% натрий азидінен тұратын, фосфатпен буферленген (РВS) (РВS Хенкс ерітіндісін қолдануға болады) физ. ерітіндіні қолданады. Жасушаларды суспензиялайды және +4°С 30 мин. инкубациялайды;

6. пп. 3-4 көрсетілгендей жасушаларды 2 рет жуады;

7. Жасушалар иммунды флюоресценциямен қарауға дайын, бірақ егер де сынаманың нәтижесін бірнеше сағаттан соң алатын болсақ, онда жасушаларды бекітеді. Ол үшін соңғы рет центрифугаланғаннан және супернатаны алып тастағаннан кейін жасушалар тұнбасына РВS-ке (РВS-ке 1:40 ерітілген формалин ерітіндісін қолдануға болады) 50 мкл 1% параформальдегидті қосады. Жасушаларды суспензиялайды. Бекітілген жасушалар флуоресценциясын бірнеше апта бойы сақтайды.

Боялған жасушаларды ағымды цитофлуориметрде талдайды немесе флуоресцентгік микроскоп арқылы қарайды. Соңғы жағдайда жасушаларды суспензиялайды, суспензияны заттық әйнекке ауыстырады, жабынды әйнекпен жабады және препаратгы флуоресценттік микроскоппен (объектив х.90) иммерсия астында карастыралады. Суреттің сапасын жоғарылату үшін окулярдың аз ғана үлкейгішгін (хЗ немесе х1,7)қолданады. Флуоресценттік емес иммерсионды майды қолданған жөн. Бақылауды қараңғы бөлмеде жүргізген дұрыс. Теріс бақылау препаратында бақыланатын антигенпозитивтік жасушалардың санын, 200 лимфоцитгерді карағанда флуоресцентті жасушалардың % алып тастағанда, флуоресценттік жасушалардың % ретінде анықтайды. Теріс бақылау ретінде, сол бойынша ұқсас дайындалған, бірақ моноклонды антиденелердің орнына жасушаларды Хенкс ерітіндісімен немесе қалыпты тышқан Іg өнделген препараттарын қолданады.

Қан сарысуындағы және басқа да биологиялық сұйықтықтағы иммуноглобулиңдердің әр класының және топшаларының (изотипердің) концентрациясы В-лимфоциттердің және де барлық гуморалдық иммунды жауаптың реттелу жүйесінің функционалдық жарамдығын көрсететін негізгі интегралды көрсеткіш болып табылады.

Иммуноглобулиндердің әр класының (ІgА, ІgG, ІgМ, ІgЕ) санын анықтайтын аспаптары ретінде әр класына тән арнайы антииммуно-глобулинді антидене болып табылады. Соңғы кездері иммуноглобулиндерің әр класына тән, әр түрлі антигендік детерминантқа (эпитоп) қарсы қолданатын моноклонды антиденелерге көңіл бөледі.

Әдеттегідей сарысулық иммуноглобулиндердің концентрациясын поликондық антиденелерді қолдану арқылы, Манчини бойынша гельдегі радиалдық иммунды диффузия әдісімен анықтайды.

Манчини әдісінің қағидалары ІgМ, ІgG, ІgА қарсы стандарттық концентрациядағы антиденелері бар зерттелетін сарысу үлгісін агардың лункасына орналастыруымен негізделген. Зерттелетін сарысу құрамындағы иммуноглобулиндер агарға диффуздайды және де керекті антиденелермен байланыса отырып, преципитация сақинасын түзеді. Лункада антигендердің артықшылғы сақталып тұрса, преципитация сақинасының диаметрі үлкейеді. Преципитация сақинасының ақырғы мөлшері қажетті иммуно-глобулиндердің концентрациясына байланысты. Манчини әдісі 10 мкг/мл тең иммуноглобулиндердің концентрациясын анықтай алады. Әдістің қателігі 10% құрайды.

Иммуноглобулиндердің санын анықтайтын едәуір сезімтал және арнайы әдіс, иммуноглобулин-антииммуноглобулинмен байланысқан, нәруыздардың агрегациясын бағалайтын нефелометриялық немесе спектрофотометриялық микропреципитация әдісі болып табылады.

Бірақ, соңғы кездері өте сезімтал иммунды ферменттік талдау әдісі кеңінен қолдануда.

Берілген әдістіц қағидасы қажетті иммуноглобулиндер қағидасына қарсы моноклонды антиденелерді, нәруыздарды тұрақты адсорбциялайтын, пластиктен жасалған арнайы планшеттің лункаларында сорбциялауымен негізделген. Егер де пластиктің беті нәруыздармен қаныққан болса, онда кейінгі адсорбция болмайды. Адсорбцияланбаған антиденелерді кетіру үшін лункаларды жуғаннан кейін, оған зерттелетін сарысуды құйып, инкубациялайды. Одан соң сарысуының байланыспаған нәруыздарынан лункаларды жуады және пероксидаза ферментімен конъюгацияланған, адам иммуноглобулиндердің қажет кластарына қарсы сарысуды енгізеді. Мұндай қарсы сарысулар тек «өзінің» моноклонды антиденелерімен адам иммуңо-глобулиндерінің сәйкес кластары байланысқан, лункаларында ғана байланысады. Жуып және лункаға сутегінің асқын тотығын және қосылыстары бар субстраттарды қосқаннан кейін, ол тотығу нәтижесінде боялған туындыларын береді, тек белгіленген ферментпен сарысудың байланысқан лункаларда ғана бояулар анықталады. Спектрофотометр арқылы барлық лункаларда сарысуындағы берілген иммуноглобулин кластарының концентрациясына тура пропорционал болатын оптикалық тығыздыкты бағалайды.

Әдістің қойылуы. Стрип лункаларына 100 мкл активтелген ерітіндіні енгізіп, 37° С температурада 30 мин. инқубациялайды. Стриптер инкубация кезінде пластикалық пакеттерге орналастырған. Инкубациядан кейін лункалардың кұрамын төгіп, лункаларды 3 рет жұмыстың буферлік ерітіндісімен жуған. Алғашқы 2 стриптің төменгі лункаларында 100 мкл калибрлік сынауды енгізген, қалған лункаларға 100 мкл талдайтын ерітілген сарысу үлгісін енгізеді және 37°С 45 мин. бойы инкубациялады. Содан соң лункалардың құрамын сілкеу арқылы түсіріп, лункаларды 3 рет жұмыстың буферлік ерітініңісімен тез арада жуған. Барлық лункаларға 100-ден конъюгат ерітінідісін енгізіп, стриптерді жауып, 37°С 30 мин. бойы инкубациялады. Содан кейін лункалардың құрамын сілкеу арқылы түсіріп, 3 рет жұмыстың буферлік ерітіндісімен жуған және құрғатқан. Барлық лункаларды қолданудың алдында дайындалған кезде үстіне алдынала 100 мкл ОФД ерітіндісін қосқан. Стриптерді кақпақпен жауып және 25-30 минут жарық жерден алыс 22±40С ұстаған. 50мкл стопреагенттерді барлық стриплункаларға қосқан. Талдаудың нәтижесін толқын ұзындығы 492 нм тең фотометриялық тіркеген. Зерттелетін үлгілерде иммуноглобулиндердің концентарциясын,оптикалық тығыздықтан алынған маңызын калибрлік графикке салу арқылы анықтады.

Екінші деңгейдегі сынамаларды әр түрлі иммундық тапшылық жағдайдағы иммундық жүйенің зақымдалу сипатын және орналасу жерін нақтылайтын кең спектрлі иммунологиялық параметрлерді анықтауда қолданады. Бірінщі деңгейдегі негізгі иммунологиялық көрсеткіштерден басқа, кеңейтілген иммунологиялық зерттеулерге, айналымдағы иммунды кешен сияқты гуморалды факторларды, комплемент жүйесінің компо-ненттерін, цитокиндер және олардың рецепторлық антагонистері, сонымен қатар жасушалардың функционалдық белсенділігін анықтау жатады.