Транскрипція
Загальні положення
Ініціація та власне транскрипція
Термінація
РНК-полімерази про і еукаріот та архебактерій
Процесинг РНК
Рибозими
1. Загальні положення
Всі типи РНК матрична (інформаційна), транспортна, рибосомальна і мала – утворюються в процесі транскрипції. При її синтезі у якості матриці використовується, як правило, молекула ДНК.
Є три принципові різниці між ДНК і РНК:
А. У РНК в якості вуглеводу виступає рибоза, а не дезоксирибоза, як в ДНК.
Б. РНК містить урацил замість тиміну.
В. За виключенням деяких вірусів, РНК одноланцюгова.
Такі зміни хімічного складу і будови змінюють хімічні властивості НК. Тому ферменти, які діють на РНК, не діють на ДНК і навпаки. Заміна тиміну на урацил не змінює здатності спарюватись з аденіном.
ДНК виконує тільки генетичну роль – тобто несе генетичну інформацію. РНК переносить її від ДНК, а також є безпосереднім носієм генетичної інформації у деяких вірусів. Проте РНК виконує безпосередньо ще й функціональну роль. Так, вона є структурним і функціональним елементом рибосом, переносником амінокислот (тРНК). Деякі типи РНК мають каталітичну (ферментативну) активність і є регуляторами експресії генів.
Транскрипція РНКз ДНК забезпечується ферментом ДНК-залежною РНК-полімеразою. Тобто фермент синтезує РНК, використовуючи нуклеотидтрифосфати, але тільки в присутності матриці ДНК. Хімізм синтезу РНК в цілому подібний до синтезу ДНК. Так, в процесі елонгації ланцюга РНК-нуклеотиди додаються до 3´-ОН-групи рибози попереднього нуклеотиду – два макроергічні зв’язки. Як звідси зрозуміло – синтез іде в напрямку 5´à3´, а природно, напрям матриці протилежний. На відміну від ДНК-полімерази, РНК-полімераза може почати синтез РНК без затравки. При цьому на 5´-кінці залишаються три залишки фосфату. Першими основами в молекулі РНК майже завжди є пурини – аденін чи гуанін. Матрицею для РНК-полімерази практично завжди є ДНК, але лишень один її ланцюг.
Рис. 5.1. Транскрипція РНК.
РНК-полімераза зв’язується з промотором. Напрям транскрипції визначається орієнтацією послідовності промотора. РНК-полімераза рухається від промотора, синтезуючи молекулу РНК.
Полімераза рухається, розплітаючи короткі фрагменти ДНК, транскрибуючи їх. Зразу ж за нею подвійна спіраль відновлюється. В результаті тимчасового розплітання азотисті основи нитки матриці відкриваються і можуть бути скопійовані комплементарно в РНК. Слід ще раз підкреслити – місце початку і напрям руху полімерази визначає промотор і його орієнтація.
Закінчується транскрипція в місцях локалізації так званих термінаторів транскрипції. Це принципово відмінно від реплікації, при якій копіюється весь геном. Тому транскрипція дозволяє синтезувати РНК з різних ділянок і з різною частотою, що залежить від потреб клітини.
2. Ініціація і власне транскрипція
Промотори відіграють ключову роль в ініціації синтезу РНК. Промоторами є специфічні послідовності на молекулі ДНК з якими з’єднується РНК-полімераза. Послідовність багатьох промоторів із різних джерел на даний час встановлена.
Рис 5.2. Структура РНК-полімерази.
Промотори розпізнаються σ-фактором РНК-полімерази. Багато промоторних послідовностей можуть розпізнаватись одним тим самим σ-фактором. На рисунку приведений один із промоторів E. coli. Активними в промотора є дві ділянки і саме вони розпізнаються σ-фактором. Одна із них – знаходиться за 10 основ від початку транскрипції, тому вона називається – 10 (Pribnowbox).Висококонсервативні ділянки ДНК, які відповідають за зв’язування з σ-фактором, називають консенсусними. У даному випадку для Прібнов-бокса – це ТАТААТ. Друга консенсусна ділянка знаходиться за ~35 пар від місця початку транскрипції. В нашому прикладі консенсусна послідовність ~35 містить ТТGАСА. Консенсусні послідовності визначаються шляхом порівняння послідовностей багатьох промоторів.
На рисунку дана послідовність лишень одного ланцюга. Між генетиками прийнято, що показаний ланцюг орієнтований своїм 5´-кінцем догори. Тому це не ланцюг, використовуваний в якості матриці РНК-полімеразою. Вказування послідовності лишень одного ланцюга економить місце і час при написанні. Але слід пам’ятати, що промотор – це ділянка ДНК і вона є дволанцюговою.
Корова частина (серцевина) РНК-полімерази взаємодіє з σ-фактором. Останній розпізнає промоторну ділянку і взаємодіє з ДНК. В результаті утворення комплексу РНК-полімерази з промотором і за наявності нуклеотидтрифосфатів здійснюється синтез РНК. Після того, як синтезувався фрагмент РНК, σ-фактор дисоціює і коровий фермент продовжує полімеризацію. Отже, σ-фактор необхідний лишень для розпізнавання ділянки промотора ініціації транскрипції.
Слід зазначити, що саме σ-фактор відповідальний за експресію тих чи інших генів. В клітині, як правило, є кілька типів σ-факторів і саме через їх відносний вміст регулюється переважно експресія тих чи інших генів. Вміст же σ-факторів у свою чергу регулюється багатьма чинниками як зовнішніми, так і внутрішніми.
3. Термінація
Термінація відбувається завдяки наявності на молекулі ДНК спеціальних термінальних послідовностей. Вони містять так звані інвертовані повтори з центральною неповторюваною ділянкою. Утворення стебла і петлі РНК зразу ж вниз від приєднання урацилів призводить до закінчення транскрипції. Транскрибування інвертованого повтору і уридинової послідовності, дозволяє утворення подвійної структури (стебла) і петлі. Саме утворення даної структури і є сигналом для закінчення транскрипції.
Рис. 5.3. Утворення петлі термінації трансляції.
Іншою ділянкою термінації є області багаті GC-послідовностями, за якими слідують AT-багаті ділянки. Такі структури призводять до термінації без додаткових факторів. Іноді їх називають „внутрішніми термінаторами”.
Ще один тип термінації передбачає участь спеціального білкового фактора. У E. coli роль такого фактора виконує білок Rho. Він не зв’язується ні з РНК-полімеразою, ні з ДНК, але міцно зв’язується з РНК і рухається вниз, вздовж РНК-полімераза-ДНК-комплексу. При проходженні Rho-залежної ділянки термінації Rho викликає дисоціацію РНК і полімерази від ДНК. Це викликає термінацію транскрипції. Інші білки, які задіяні в термінацію транскрипції, діють аналогічно Rho. У всіх випадках послідовність, задіяна в термінацію, діє на рівні РНК. Проте, слід пам’ятати, що РНК синтезується на ДНК як на матриці. Отже місця термінації визначаються специфічною послідовністю нуклеотидів ДНК.
4. РНК-полімерази
Істотно відрізняються у про-, еукаріотів та архебактерій. Найкраще вивчений фермент E. coli. Він складається з 4 різних типів субодиниць α, β, β´ і σ. Є дві копії α-субодиниці. Всі субодиниці, за виключенням σ-субодиниці, взаємодіють досить сильно. Вони утворюють так званий коровий (серцевинний) фермент РНК-полімеразу. Коровий фермент може сам каталізувати утворення РНК. Роль σ-фактора полягає в розпізнаванні специфічної ділянки ДНК, для ініціації синтезу.
РНК-полімераза – великий фермент і утворює контакти з багатьма основами ДНК одночасно. Вона взаємодіє з великою боріздкою ДНК. Знову ж для початку реплікації РНК-полімераза спочатку повинна коректно ідентифікувати місце зв’язування на ДНК – тобто – промотор.
РНК-полімераза еукаріот
Відомо 3 типи РНК-полімерази еукаріотів. Кожен з них відповідає за синтез специфічної РНК. Всі вони досить складні і містять багато типів рРНК. РНК-полімераза II синтезує всі іРНК. РНК-полімераза III синтезує тРНК і один тип рРНК. Кожен з цих типів розпізнає лишень свій тип промоторів. У бактерій промотор, який обслуговує ген, що кодує білок, може бути дуже подібний на промотор гену, що кодує тРНК. У еукаріотів такого не буває.
РНК-полімераза специфічно взаємодіє з промотором, але ця взаємодія значно складніша, ніж у бактерій. В ній задіяно багато інших білків.
промотор
Рис. 5.4. Ініціація трансляції у еукаріот.
Полімераза має повторні послідовності на одному кінці, які можуть бути фосфорильовані. Решта з багатьох білків також задіяні в ініціацію Приведений тут промотор містить ТАТА-бокс – дуже консервативний, щось на зразок Прібнов-бокса у бактерій. Він знаходиться біля місця початку транскрипції. Одна або дві такі послідовності, зазвичай, розпізнаються полімеразою II. Не виключено, що термінація транскрипції каталізована полімеразою II відбувається подібно в усіх генах.
РНК-полімераза архебактерій
Архебактерії подібно до бактерій мають одну РНК-полімеразу, але вона більш подібна на полімеразу еукаріот, ніж бактерій. Більшість промоторних послідовностей архебактерій містить консервативні АТ-послідовності з 6-8 пар основ біля 18-27 пар вище місця початку транскрипції. Дана послідовність нагадує Прібнов-бокс бактерій, але більш подібна з послідовністю і за місцезнаходженням до ТАТА-бокса промоторної ділянки РНК-полімерази II. ЇЇ називають ТАТА-послідовністю. Термінація в деяких випадках в місцях інвертованих повторів за якими слідують багаті АТ-ділянки.
5. Процесинг РНК
У прокаріотів кодуючі білок транскрипти копіюються у відповідну іРНК з якої безпосередньо синтезується білок. Проте, транскрипти інших типів генів повинні пройти процес „достигання” – процесинг. У еукаріотів усі транскрипти повинні достигати перш, ніж бути використаними. Перетворення попередника РНК в зрілу молекулу РНК називається процесингом – достиганням.
У про- і еукаріотів тРНК і рРНК спочатку синтезуються як довгі молекули попередників. Після цього вони „достигають”. В еукаріотів, гени яких містять послідовності, що не кодують амінокислоти – інтрони, чергуються з екзонами. Ці області несуть інформацію про послідовність амінокислот. Первинний транскрипт із такого гену має бути істотно модифікований, перш ніж його можна буде використати для синтезу білка. Тільки в кількох випадках інтрони, виявлені в ДНК, яка кодує білок у бактерій та бактеріофагів. Процес, в ході якого видаляються інтрони, а екзони з’єднуються, називають сплайсингом (splicing – скріплення, зрощування).
Рис. 5.5. Процесинг РНК еукаріот.
Еукаріоти мають унікальний механізм для видалення інтронів з пре-іРНК. В процесі беруть участь кілька типів рибонуклопротеїдів, які називають сплайсмосомами. Вони містять малу РНК і кілька білків.
Інтрони вирізаються і деградують. Проте, останнім часом накопичуються дані, що інтрони можуть виконувати певні функції. Вирізання деяких інтронів тРНК і генів у мітохондріях і хлоропластах здійснюють білки. Кілька інтронів, включаючи деякі знайдені в бактеріях та бактеріофагах вирізаються самостійно, тобто вони є рибозимами.
РНК еукаріотів піддається при достиганні ще двом процедурам – ще до виходу з ядра. Перший крок – так зване кепіювання (cap - шапка). Кепіювання здійснюється ще до закінчення транскрипції. Суть його полягає в тому, що до5´-кінця додається метильований гуанідин, який називається кепом.
Після транскрипції багато основ у іРНК метилюються. Окрім того 2´-гідроксильні групи рибози також можуть метилюватись. На 3´-кінці іРНК при достиганні приєднуються полі-А хвіст (tail). Цей процес може проходити паралельно з термінацією. Всі ці три етапи призводять до утворення зрілої іРНК еукаріотів.
6. Рибозими
Раніше вважалось, що роль РНК у нуклеопротеїдних комплексах, наприклад, рибосомах структурна. Каталітичні функції здійснюються білками. Теломераза дала інший приклад – тут РНК використовується як матриця. Проте, було встановлено, що певні типи РНК можуть діяти як каталізатори. Каталітичні РНК, які називають рибозимами, задіяні в багато клітинних процесів. Такі біокаталізатори діють як класичні білки – ферменти – тобто, вони мають активний центр, зв’язують субстрати і каталізують утворення продуктів. Рибозими знайдені в про- і еукаріотах, а також в органелах. Виявлено, що деякі дуже короткі РНК, які складаються з 19 основ, функціонують як рибозими.
Більшість рибозимів є інтронами, що самостійно вирізаються і з’єднують кінці екзонів, що залишаються. В одному із найкраще вивчених випадків у найпростішого Tetrahymena інтрон, що складається з 413 основ, діє як рибозим і вирізається із довгого попередника РНК. В даному випадку інтрон-рибозим діє як специфічна до певної послідовності ендорибонуклеаза, яка самовирізається з попередника іРНК. При цьому до неї приєднується нуклеотид гуанідин. Після з’єднання екзонів від рибозиму-інтрону відщеплюється короткий олігонуклеотидний фрагмент, а довша частина утворює кругову замкнену структуру.
Рис.5.6. Принцип дії рибозимів.
Ні в одному із приведених щойно процесів не беруть участі складні білки. Такий тип самовирізання (self-splicing) названо I. У II типі самовирізання здійснюється сплайсмосомою, але задіяні білки не мають активності РНКази. У наведених прикладах, на відміну від відомих білків-каталізаторів, рибозими діють один раз.
Відомі і інші класи рибозимів, які діють багато разів. Прикладом такого ензиму є РНКаза Р. Вона не руйнує сама себе. По суті, це – рибонуклопротеїд. Але тут саме мала РНК (377нуклеотидів у E. coli) є каталітичним компонентом. Аналогічно з білковими каталізаторами, всі рибозими мають бути вірно складені в просторі, тобто мати вірну вторинну і третинну структури. Роль білка в такого роду комплексах зводиться, ймовірно, до створення і підтримання вірної просторової конформації. У зв’язку з переглядом ролі РНК і виявлення її каталітичних властивостей, переглядається і функція рРНК при синтезі білка.
Лекція 6