70

Лекція 1

Вступ до молекулярної біології

1. Предмет та завдання молекулярної біології

2. Історія розвитку (реферат)

3. Основна догма молекулярної біології

1. Предмет та завдання молекулярної біології

Молекулярна біологія – наука, яка вивчає функціонування живих організмів через призму хімічної структури молекул, що входять до складу організмів. Молекулярна біологія вивчає основні властивості і прояви життя на молекулярному рівні.

1953 р.– це рік народження молекулярної біології, бо саме тоді Уотсон і Крік відкрили подвійну структуру ДНК. Далі було відкрито триплети і синтез гену.

Основними завданнями молекулярної біології є:

• вирішення проблем молекулярних основ злоякісного росту;

• попередження наслідуваних захворювань ферментативного каталізу;

• вияснення молекулярних основ дії гормонів, токсичних та лікарських властивостей речовин;

• пізнання механізмів пам’яті.

Відповідно до них сформувались найважливіші напрямки молекулярної біології:

-дослідження структурно-функціональної організації генетичного апарату клітин і механізмів взаємодії генетичної інформації (молекулярна генетика);

- дослідження молекулярних механізмів взаємодії вірусів з клітинами (молекулярна вірусологія);

- вивчення закономірностей імунних реакцій організму (молекулярна імунологія);

- вивчення появи різноякісних клітин в ході індивідуального розвитку організмів і сигналізації клітин (молекулярна біологія розвитку).

Основні об’єкти дослідження молекулярної біології - віруси, клітини і субклітинні структури, макромолекули та їх комплекси.

Досягнення молекулярної біології:

1. Розшифрування структури білків (Полінг, Перусц, Сенджгер);

2. Вивчення структури та біологічних функцій нуклеїнових кислот та рибосом (Спірні);

3. Визначення генетичного коду (Штернберг, Очоа);

4. Відкриття механізму біосинтезу білків (Крік, Жакоб, Моно) та нуклеїнових кислот (Конберг, Очоа);

5. встановлення структури вірусів, їх реплікації, розробка методів генної інженерії (Берг, Сміт);

6. Синтез штучного гену (здійснювався під керівництвом Корана).

Практичне значення молекулярної біології:

- в с/г - направлена і контрольована зміна генетики тварин і рослин для отримання високоефективних порід та сортів;

- в мікробіологічній промисловості – бактеріальний синтез біологічно активних речовин;

- молекулярна біологія - теоретична основа різних розділів медицини (вірусології, імунології тощо).

3. Основна догма молекулярної біології визначає напрямок передачі генетичної інформації.

Основним носієм генетичної інформації є ДНК. Подвоєння молекул ДНК у процесі реплікації та передавання нащадкам материнських копій є основою консерватизму спадковості, збереження протягом багатьох поколінь біологічних ознак виду. Ця біологічна функція здійснюється за рахунок передачі закодованої в ДНК інформації молекулам інформаційних (матричних) РНК в процесі транскрипції та подальшого розшифрування цієї інформації при синтезі білків (трансляції). Сукупність зазначених біологічних функцій ДНК та механізмів їх реалізації отримала назву центральної догми молекулярної біології.

Рис. 1.1. Загальна схема реалізації спадкової інформації.

Етапи переносу інформації: реплікація, транскрипція, трансляція. 3 типи інформаційних молекул : ДНК, РНК та білки.

- етап 1 – реплікація – дволанцюгова молекула ДНК подвоюється – утворюються 2 ідентичні молекули.

- етап 2 – транскрипція – на дволанцюговій молекулі ДНК (на одному її ланцюзі) синтезується молекула РНК, комплементарна 1 ланцюгу ДНК. На даному етапі неможливий зворотний перенос інформації з РНК на ДНК.

- етап 3 – трансляція – по молекулі РНК синтезується молекула білка. Існує гіпотеза, що, можливо, у випадку пріонів існує перенос інформації з білка на РНК.

Біосинтез РНК на ДНК-матриці отримав назву транскрипції. Загальні закономірності цього процесу близькі у про- і еукаріотів. Послідовність включення рибонуклеотидів у рибонуклеотидний ланцюг у процесі транскрипції програмується послідовністю нуклеотидів в матричній ДНК.

Розрізняють кодуючий ланцюг ДНК, тобто такий, з якого зчитується інформація, та некодуючий ланцюг. У дволанцюговій ДНК, яка містить багато генів, для деяких генів кодуючим може бути один з ланцюгів, для інших генів – другий ланцюг.

Транскрипція РНК різних класів на матричній ДНК каталізується ферментами, ДНК-залежними РНК-полімеразами (РНК-полімеразами), які розрізняються у прокаріотичних і еукаріотичних організмів. На відміну від ДНК-полімераз, РНК-полімерази здатні до самостійної ініціації синтезу полінуклеотидного ланцюга, зв’язуючись у певних ділянках (сайтах) з матричною ДНК.

Етапи синтезу РНК у прокаріотів:

1. Зв’язування РНК-полімерази з ДНК-матрицею.

2. Ініціація синтезу полірибонуклеотидного ланцюга.

3. Елонгація (продовження) синтезу РНК.

4. Термінація, тобто закінчення синтезу РНК (так званого первинного РНК-транскрипту).

ПРОКАРІОТИ

поліцистронна

іРНК

трансляція

білок А

Рис. 1.2. Біосинтез білка у прокаріот.

Безпосередньо ініціація починається із включення в ланцюг першого (кінцевого) нуклеотиду, яким у всіх мРНК є пуриновий нуклеозидтрифосфат. Швидкість процесу ініціації залежить від структури промоторних послідовностей, що передують точкам ініціації. Існують сильні та слабкі промотори транскрипції:

• сильні промотори спричиняють ініціацію відповідних РНК з частотою до одного акту ініціації на секунду;

• слабкі спричиняють ініціацію транскрипції з частотою близько одного акту початку синтезу РНК на 10 хвилин.

Взаємодія РНК-полімерази з ДНК-матрицею блокується протипухлинним антибіотиком актиноміцином Д.

Інгібіторами ініціації є антибактеріальні антибіотики рифаміцин та рифампаміцин, якими блокують зв’язування перших нуклеозидтрифосфатів з активними центрами β-субодиниці РНК-полімерази.

У клітинах прокаріотів, зокрема, в найбільш вивченій бактеріальній клітині – E. coli, молекули мРНК синтезуються одразу у “зрілому” вигляді, тобто готовими для виконання своїх біохімічних функцій. Є іще одна суттєва відмінність у реалізації генетичної інформації між про- і еукаріотами. Генетичний матеріал у прокаріотів не відділений від цитоплазми. Тому нерідко на молекулі і-РНК, що транскрибується, рибосоми синтезують білок, тобто здійснюється трансляція. У еукаріотів таке неможливо, бо синтезована іРНК повинна з одного боку пройти процес дозрівання, а з іншого – вийти в цитоплазму, де знаходиться апарат синтезу білка. Окрім всього такі особливості локалізації процесів транскрипції і трансляції можуть частково пояснити, чому відповідь білоксинтетичного апарату в еукаріотів відбувається значно повільніше, ніж у прокаріотів. Швидкість експресії генів прокаріот – 1 хв., еукаріотів – 10-20 хв.

Отже, в результаті процесів біосинтезу полірибонуклеотиду в еукаріотичній клітині утворюється первинний транскриптор (пре-мРНК), який здатний до перетворення у функціонально повноцінну молекулу в результаті процесингу (дозрівання).

Рис. 1.3. Біосинтез білка у еукаріот.

Процесинг первинного транскрипту включає в себе:

• приєднання до 5'-кінця молекули специфічної нуклеотидної структури, так званого “кепу”;

• приєднання до 3'-кінця первинного транс крипту поліаденілатного “хвоста” – poly(A)-послідовності. Значення кепіювання та поліаденілювання полягає у підсиленні трансляційної активності зрілої мРНК та протидії руйнуючому впливу клітинних РНКаз;

• вирізання неінформативних послідовностей нуклеотидів з молекул пре-іРНК та зшивання внутрішніх кінців молекул – сплайсинг. Процес сплайсингу забезпечує видалення з первинних транскриптів інтронів, тобто послідовностей, які не транслюються.

Зріла мРНК, тобто така, що була піддана реакціям кепіювання на 5'-кінці, поліаденілювання на 3'-кінці, сплайсингу та метилюванню окремих нуклеотидів, надходить з ядра в цитоплазму у вигляді рибонуклеопротеїдних комплексів, що здатні взаємодіяти з рибосомами в процесі трансляції.

Лекція 2

ДНК – структура і функції

1. Структурна організація ДНК

2. Організація генетичного апарату еукаріотів

3. Нуклеопротеїди прокаріотів

4. ДНК мітохондрій і хлоропластів

1. Структурна організація ДНК

Запропонована у 1952 р. Уотсоном і Кріком модель подвійної спіралі ДНК в цілому приймається й зараз, хоча періодично з’являються й інші моделі. Виходимо з того, що подвійна спіраль ДНК утворюється остовом залишків дезоксирибози, з`єднаних фосфодиефірними мостиками. Взаємодія між антипаралельними ланцюгами ДНК забезпечується за рахунок водневих зв’язків між комплементарними парами азотистих основ. (від 14.12р.5761) Важливу роль також відіграють так звані стекинг-взаємодії між азотистими основами одного й того ж ланцюга. ДНК утворює первинну, вторинну, третинну і четвертинну структури (HMB-2.2).

Для подвійної спіралі ДНК характерна наявність так званих великої і малої боріздок – HMB-F2.2 (від 14.8. г.571) Кінці молекул ДНК можуть бути вільні, або замінені з утворенням кільцевої структури. Як правило, ДНК прокаріотів має кільцеву структуру, а ДНК еукаріотів – лінійну. ДНК деяких вірусів, як наприклад, бактеріофага λ може мати як замкнену, так і незамкнену кільцеву структури(від 14.23.р.587).

ДНК-лігаза

Ковалентні зв’язки між кінцями ДНК утворюються під дією ДНК-лігази. Кільцева ДНК утворює суперспіралі. Суперспіралізація регулюється спеціальними білками – топоізомеразами. В клітині прокаріотів фактично немає зв’язаних білків. В той же час ДНК еукаріотів зв’язана з чисельними білками, які відіграють важливу роль у функціонуванні генетичного апарату.

2. Організація генетичного апарату еукаріотів

Генетичний апарат еукаріотів являє собою дуже складно організовані нуклеопротеїдні комплекси. В їх складі ДНК взаємодіє з різними типами білків з утворенням хроматину. В стані „спокою” клітини, які не діляться, містять аморфний хроматин, розподілений у ядрі. Безпосередньо перед поділом (мітозом) хроматин реорганізовується в компактні структури (фібри), що прийнято називати хромосомами. В середньому кожна із 46 хромосом людини містить 1,3 *10⁸ нуклеотидних пар і має довжину біля 5 см. Тобто загальна довжина геному однієї клітини людини понад 2 м. Постає запитання про те, яким чином в клітині організована ДНК та такий великий генетичний апарат ?

Першою стадією організації прийнято вважати утворення структури „короликів на нитці”, яка складається з ДНК, асоційованого з сильно лужними білками – гістонами. Ці білки міцно зв’язуються з ДНК з утворенням дуже стабільних комплексів, такі структури намиста виявлені при електронній мікроскопії обробленого розчинами з низькою йонною силою. Відомо п’ять типів гістонів: Н1, Н2А, Н2В, Н3 та Н4. Гістони Н2А, Н2В, Н3 та Н4 – білки з молекулярною масою 11-15 кД , Н1 – ~21кД. Це висококонсервативні білки. У хребетних виявлено ще один гістон – Н5, функції якого близькі до таких Н1. Оскільки гістони сильно лужні, то їх взаємодія з сильно кислим поліфосфатним ланцюгом нуклеїнових кислот призводить до утворення незаряджених нуклеопротеїдів.

Основу нуклеосоми складає октамер з гістонів по дві молекули: Н2А, Н2В, Н3 та Н4. Гістони взаємодіють з малою боріздкою ДНК, залишаючи велику для взаємодії з білками, що регулюють експресію ДНК та інші їх функції.

Рис. 2.1. Будова нуклеосоми.

Гістони беруть участь у суперспіралізації ДНК еукаріотів, бо, на відміну від прокаріотів, у них мало топоізомераз. В полінуклеосомах нуклеосоми з’єднані „лінкерною” (зв’язуючою) ДНК. Полінуклеосоми – періодично повторювані нуклеосоми, які складаються з гістонів і ДНК. (8.14.43, р.605).

Далі полінуклеосоми укладаються в так звані 70 нм волокна, які в свою чергу, упаковуються в 30 нм волокна, які виявляються електронним мікроскопом. Вищими порядками організації є утворення соленоїдів, тощо. Окрім гістонових білків з ДНК еукаріотів зв’язані чисельні білки, які беруть участь в обміні нуклеїнових кислот та його регуляції.

3. Нуклеопротеїди прокаріотів

Як правило, у клітинах прокаріотів ДНК організована в одну хромосому, яка є кільцевою подвійною суперспіраллю. Проте, деякі бактерії можуть мати більше, ніж одну хромосому і остання може бути лінійною. У прокаріотів немає гістонів, але натомість вони мають білок НU з молекулярною масою ~18кД, який подібний до гістонів. Він існує як гетеродимер з двох майже ідентичних субодиниць НU1 та НU2. Зв’язування НU з ДНК in vitro компактує нуклеїнові кислоти і утворює суперспіраль, причому ступінь ефекту залежить від концентрації нуклеїнових кислот. Ще один розповсюджений подібний до гістонів білок Н-NS також може бути відповідальним за організацію хромосоми або безпосередньо, взаємодіючи з ДНК, або опосередковано – через НU-білки.

Бактеріальні хромосоми організовані в компактні структури – нуклеоїди, вони стабілізуються, взаємодіючи з білками та РНК. У випадку Е. соli нуклеоїд складається з приблизно 100 основ ДНК, упакованих в гілкоподібні структури з білком та РНК (від ? 14.46 р. 609). Геном E. coli складається з ~4,5 *10⁶ основ, які при лінеаризації матимуть довжину 1,5 нм, що в 80 раз довше клітини бактерії. Хоча нуклеоїд по аналогії з хроматином еукаріотів організований в петлеподібні домени, ці структури далі не компактуються, як у еукаріотів. Хромосоми бактерій динамічні, вони утворені з ДНК та подібних до гістонів білків, які можуть швидко дисоціювати. Це може бути пов’язане з потребою швидкого синтезу ДНК, поділом клітини та переходами, що характерні для бактерій. На протилежність цьому, гістони зв’язані з ДНК еукаріотів сильніше, тому можуть дисоціювати тільки в тих частинах геному, які задіяні у синтезі ДНК, репарації, рекомбінації чи транскрипції.

Більшість ДНК прокаріотів кодує специфічні білки. Решту складають регуляторні області тощо. В еукаріотів для кодування всіх генів достатньо тільки біля 10% ДНК. Решту складає ДНК центромер і теломер, але функції основної частини невідомі, хоча вони можуть відігравати певну роль в регуляції експресії генів у процесі розвитку.

4. ДНК мітохондрій (мітДНК = мДНК)

мДНК – невелика подвійна замкнена структура, що містить біля 16500 пар основ. У ссавців мДНК становить близько 1% загального вмісту ДНК в клітині. В мітохондріях є багато копій ДНК, зазвичай, розподілених у кількох кластерах. Загальна кількість копій на клітину може сягати 1000. Швидше всього геном мітохондрій організований за принципами такого прокаріотів, а саме:

• бактеріальний і мітохондріальний геноми складаються із замкнених молекул ДНК;

• бактеріальні та мітохондріальні геноми не є безперервними;

• мітохондріальні іРНК не піддаються процесингу, тобто кепіюванню на 5’- та поліаденілюванню на 3’-кінці;

• деякі триплети мітохондріальної ДНК кодують амінокислоти у спосіб, відмінний від такого у ядерної ДНК.

Аналіз послідовностей мДНК може дати унікальну інформацію про походження клітини чи організму. Це можна проілюструвати двома факторами:

1. мДНК, подібно до бактеріальної, слабко репарується. Це є причиною високого рівня мутацій. Така особливість дозволяє використовувати мДНК як “годинник” шляхів клітинної еволюції. Згідно з однією з гіпотез, старіння також пов’язане з акумуляцією мутацій мДНК, які призводять до зниження генерації енергії.

2. На відміну від ядерної ДНК, мітохондріальна не має статі. Клітина спермія вносить тільки 1/10000 кількості мДНК, яку вносить в зиготу ооцит. Це фактично означає, що у людини мДНК успадковується по материнській лінії через цитоплазму ооциту. Рідкісними випадками успадкування мДНК може бути рекомбінація її в яйцеклітині чи разом з ядерною ДНК. Слід додати, що сперматозоїди не передають в яйцеклітину жодних інших цитоплазматичних органел.

мДНК, потрапляючи в ядро, може вмонтовуватись в ядерні гени, утворюючи химерні послідовності. У ссавців багато мітохондріальних генів перейшли в ядро. Про це свідчить вище відношення мітохондріальна/ядерна ДНК у рослин і жаб, порівняно із таким у ссавців. З іншого боку мітохондріальний геном не є автономним, адже багато білків, які кодуються ядерною ДНК, необхідні для реплікації мДНК і транскрипції. Отже, немітохондріальні гени абсолютно необхідні для нормального функціонування мітохондрій. Тому мутації геномної ДНК можуть викликати мітохондріальні хвороби, хоча й дихання клітини регулюється мітохондріальним геномом.

мДНК людини містить – 16569 пар основ і 37 генів. 13 з них кодують білки, які є субодиницями факторів, необхідних для підтримки синтезу АТФ мітохондріями, решта 24 гени кодують специфічні для мітохондрій РНК (2 рибосомальні – 12S та 16S і 22 транспортні РНК).

Швидкість мутації мДНК в 10 раз вища, ніж ядерної. Ця висока частота мутацій, імовірно, віддзеркалює низьку точність реплікації ДНК, її репарації, або обох процесів разом. Крім того мДНК піддається більш інтенсивній дії ендогенних мутагенів –активних форм кисню (АФК). Останні утворюються в мітохондріях як побічний продукт метаболізму О₂.

Мітохондріальні гени наслідуються по материнській лінії, бо мітохондрії сперматозоїдів при заплідненні не входять в яйцеклітину.

Лекція 3