ЗАНЯТИЕ 4
ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Характер роста микробов на жидких и плотных питательных средах. Колонии микроорганизмов. Пигментообразование у бактерий. Бактериологический метод (второй этап). Выделение чистой культуры бактерий.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить характер роста микробов на жидких и плотных питательных средах. Изучить характеристику колоний микроорганизмов. Ознакомиться с пигментообразованием у бактерий. Освоить второй этап бактериологического исследования - выделение чистой культуры бактерий.
ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1. Изучить характер роста микробов на жидких и плотных питательных средах.
2. Освоить характеристику колоний микроорганизмов.
3. Ознакомиться с пигментообразованием у бактерий.
4. Освоить второй этап бактериологического исследования - выделение чистой культуры бактерий.
Характер роста микробов на питательных средах
Рост микробов на плотной питательной среде. Для изучения свойств колоний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При этом посев материала проводят таким образом, чтобы получить изолированные колонии. Для характеристики колоний используют следующие признаки:
1. Размер колонии. Колонии обычно измеряют в миллиметрах или пользуются для этого описательными терминами, такими, например, как точечные (диаметр менее 1 мм), мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм) и крупные (диаметр 4-6 мм и более).
2. Форма колонии. Бывает правильной (круглая), неправильной (амебовидная), ризоидной (корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев).
3. Контуры края. Определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные края (фестончатый, волнистый, эрозированный или зазубренный, бахромчатый).
4. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и формой на вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или при помощи лупы при рассматривании сверху и сбоку. Различают каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы, плоско-выпуклые колонии, конусообразные колонии, колонии с приподнятой серединой, колонии с вдавленным центром, плоские колонии.
5. Поверхность колонии. Изучают при помощи лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колонии бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкий), шероховатые - буквой R (rough - шероховатый).
6. Цвет колонии. Определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.
7. Структура колоний. Определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. По структуре различают гиалиновые колонии, зернистые колонии, нитевидные или волокнистые колонии.
8. Консистенция колоний. Исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей. По характеру консистенции колонии бывают пастообразные, вязкие или слизистые, волокнистые или кожистые, хрупкие сухие.
Особенности микробного роста на жидких питательных средах.
1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды.
2. Придонный рост бактерий, характеризующийся образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой.
3. Пристеночный рост бактерий, выражающийся в образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда.
4. Поверхностный рост бактерий, характеризующийся появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки.
Рост на полужидкой питательной среде характеризуется помутнением всей толщи среды или образованием сосульки цилиндрической или конической формы.
Пигментообразование у бактерий
Многие сапрофитные и некоторые патогенные микроорганизмы в процессе жизнедеятельности на питательных средах способны образовывать пигменты различного цвета. Образование пигментов происходит в присутствии кислорода, при пониженном освещении и температуре 20-25ОС. Их классифицируют по цвету, химическому составу (каротиноиды, пирролы, азахиноны, феназины и др.), растворимости, по способности диффундировать в окружающую среду и другим признакам. Пигменты класса каротиноидов имеют белый, желтый, оранжевый, красный, бежевый цвет. Они обнаружены у стафилококков, сарцин, микрококков, микобак-терий, коринебактерий, пурпурных бактерий, дрожжей. Пигмент феназинового класса синего цвета - пиоцианин присутствует у синегнойной бактерии. Пирролловый пигмент красного цвета - продигиозин выявлен у серратий (S. marcescens). К азахинонам принадлежит индигоидин - синий пигмент, выделяемый коринебактериями, псевдомонами, артробактерами и др. Производным индола является пигмент виоласеин, придающий сине-фиолетовую окраску колониям хромобактера. Бактериохлорофиллы встречаются у зеленых, красных несерных бактерий и др. К классу пиразиновых пигментов относится пулъхерримин, окрашивающий колонии грибов рода кандида в темно-красный цвет. Грибы обычно активно продуцируют пигменты широкой цветовой гаммы. Цвет пигмента зависит от состава питательной среды и условий культивирования. Важными элементами для образования пигментов являются азот, магний, железо, некоторые аминокислоты.
Пигменты подразделяют на растворимые в воде или в жирорастворителях (спирте, ацетоне, эфире) и нерастворимые в воде и спирте. Водорастворимые (феназиновые, пиразиновые) способны диффундировать в окружающую среду и окрашивают не только колонии микроорганизмов, но и питательные среды. Спирторастворимые (каротиноиды) и нерастворимые (птерины, меланины) тесно связаны с клеткой (хромофорные) и окрашивают только колонии микроорганизмов.
Пигменты локализуются во внутриклеточных выростах ЦПМ, имеющих вид трубочек или пузырьков (у пурпурных бактерий), в тилактоидах - системах элементарных мембран цитоплазмы (у цианобактерий), в фикобилисомах (гранулах, локализованных в цитоплазме на поверхности тилакоидов).
В жизни микроорганизмов пигменты имеют важное значение. Пигментированные клетки более устойчивы к действию солнечных, ультрафиолетовых лучей, некоторые из них способны продуцировать антибиотические вещества, участвуют в процессах бактериального фотосинтеза и фототаксиса. Цвет пигмента может быть использован в качестве диагностического признака при идентификации микроорганизмов.
Выделение чистой культуры бактерий
Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида и полученную как потомство одной клетки. Чистые культуры можно получить из исходной микробной клетки, изолированной при помощи микроманипулятора, или из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой. Для выделения чистой культуры используют следующие методы.
1. Метод Дригалъского. При этом методе расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем распределяют его по поверхности питательной среды. Затем шпатель переносят во вторую и далее в третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал. При посеве этим методом на второй и на третьей чашках вырастают изолированные колонии. Полученные отдельные колонии пересевают в пробирки с питательной средой для получения чистой культуры микроорганизма.
2. Метод параллельных штрихов. При этом способе материал с помощью бактериологической петли распределяют по поверхности агара параллельными штрихами в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.
3. Метод Коха (метод рассева в глубине среды). При этом методе в пробирку с агаром, расплавленным и остуженным до 43-45°С, вносят одну бактериологическую петлю исследуемого материала и тщательно перемешивают. После этого из этой пробирки одну петлю материала переносят во вторую пробирку, а затем из нее – в третью пробирку. Приготовленные разведения бактерий выливают из пробирок в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Характер роста бактерий в жидких, на полужидких и плотных питательных средах.
2. Характеристика колоний микроорганизмов.
3. Пигменты бактерий и их роль для микроорганизмов.
4. методы выделения чистых культур бактерий.
Литература для подготовки к занятию:
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
Дополнительная литература:
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.