Лабораторная диагностика кампилобактериозов

В зависимости от формы кампилобактериоза и локализации патологического процесса материалом для исследования служат кровь, спинномозговая жидкость, фекалии, рвотные массы и т.д. Кампилобактеры плохо переносят транспортировку. Для транспортировки взятых образцов в бактериологическую лабораторию используют транспортную питательную среду Cary-Blair, среду для контроля стерильности с рН 8,5 или щелочную пептонную воду.

1 этап

Из доставленного материала готовят мазки на предметных стеклах и окрашивают их по Граму. При наличии в пробе кампилобактеров в мазке обнаруживают грамотрицательные тонкие, спирально изогнутые палочки S- и С-образной формы длиной 0,5-8,0 мкм, которые часто соединяются в короткие цепочки в виде "крыльев летящей чайки". Для ускоренной ориентировочной диагностики кишечного кампилобактериоза тонкий мазок фекалий фиксируют над пламенем, в течение 10-20 с. окрашивают водным раствором основного фуксина и промывают водой. За такой короткий промежуток времени большая часть находящейся в мазке сопутствующей микрофлоры прокраситься не успевает, в то время как кампилобактеры можно легко определить по характерной морфологии.

Кампилобактеры растут при концентрации кислорода в газовой среде от 5 до 17%. Посев исследуемого материала производят на плотную питательную среду, приготовленную на основе эритрит-агара, в которую после охлаждения до 45-50°С добавляют 5% гемолизированной крови барана и реагенты для повышения аэротолерантности микроорганизмов (пируват натрия, сульфат железа и метабисульфит натрия).

Для освобождения от сопутствующей микрофлоры используют два способа. Первый способ заключается в добавлении к питательной среде смеси антимикробных препаратов (полимиксин, рифамапицин, амфотерицин В, ристомнцин и фузидин), позволяющих выделять возбудитель из ассоциации микроорганизмов. Второй способ основан на способности кампилобактеров проходить через фильтры с диаметром пор 0,5-0,6 мкм, в то время как большинство представителей сопутствующей флоры при фильтровании задерживается. Стерильные мембранные фильтры помещают на поверхность шоколадного или кровяного агара и наносят на них несколько капель 10% суспензии исследуемого материала. Через 30 мин фильтры убирают, чашки с посевами помещают в анаэростат или эксикатор и культивируют при температуре 42°С.

Для создания микроаэрофильных условий культивирования используют газовую среду следующего состава: 5% кислорода, 10% двуокиси углерода и 85% азота. При отсутствии оптимальной газовой смеси используют "сосуд со свечой. В ряде случаев можно использовать газогенерирующие пакеты, принцип действия которых основан на каталитическом поглощении кислорода в замкнутом пространстве (анаэростате и др.) до концентрации 5-7% и генерации двуокиси углерода химическим способом.

2 этап

Спустя 2-4 сут. инкубации, на плотных питательных средах вырастают колонии двух типов. На свежеприготовленных питательных средах вырастают колонии плоские, влажные, блестящие, с тенденцией к ползучему росту, напоминающие растекающиеся капли конденсата. При уменьшении влажности питательных сред в процессе хранения на плотных средах вырастают колонии второго типа: более плотные, выпуклые, полупрозрачные, негемолитическне, диаметром 1-2 мм, трудно отличимые от колоний, контаминирующей микрофлоры. При наличии достаточного количества чистой культуры возбудителя готовят мазки и окрашивают их по Граму, определяют подвижность микроорганизмов методом "раздавленной" капли, ставят тесты на каталазу, оксидазу, гидролиз гиппурата натрия и определяют чувствительность к налидиксовой кислоте. При наличии небольшого количества колоний кампилобактеров изолированную колонию с характерными культуральными свойствами пересевают для накопления на плотную питательную среду и выращивают в микроаэрофильных условиях в течение 48 ч.

3 этап

После получения чистой культуры возбудителя ставят указанные выше тесты и производят окончательную идентификацию выделенных микроорганизмов

Антигенная структура кампилобактеров сложная, особенно состав термолабильных Аг. Важнейшие поверхностные Аг представлены липополисахаридами (О-Аг) и кислоторатворимыми белковыми фракциями, играющими ведущую роль в серотипировании. Общий Аг энтеробактерий отсутствует. Идентифицирован жгутиковый Н-Аг. В ответ на эти Аг кампилобактеров антитела появляются в крови в ранние сроки (на 5-е сут. заболевания титр антител достигает 1:5000) и сохраняются в ней длительное время после заболевания.

Серологический метод исследования играет весьма важную роль особенно при широкомасштабных эпидемиологических исследованиях. В диагностике же отдельных случаев заболевания его роль невелика. РА ставится с аутоштаммами или живой музейной культурой, более четкие результаты получают с формалинизированной культурой. Значимый титр в РА - 1:8—1:32 появляется на 2ой неделе. РСК видоспецифична, она требует применения специального видового антигена. Наиболее чувствительными являются РИФ и ИФМ, эти системы разработаны за рубежом, а в РФ-экспериментальные партии для РНГА.

Лабораторная диагностика сальмонеллезных гастроэнтеритов.

Основные возбудители: S. typhimurium, S. heidelberg, S. enterica, S. derby и др

Основным возбудителем сальмонеллёзов в последние годы стала S. enterica. Вид S.enterica имеет 7 подвидов: S.choleraesuis, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae, S.bougori, S.indica.

1.Забор материала.

а. Испражнения исследуют с первых дней заболевания и до выписки больного из cтационара: в первый раз — до начала антибактериальной терапии, в последующем — после окончания (не ранее 48 ч). Вероятность выделения сальмонелл из испражнений наибольшая на 1 нед заболевания, на 2 и 3 нед она снижается в 2-6,7 раза соответственно. При гастроинтестинальной форме возбудителя чаще выделяют из испражнений преимущественно на 1 нед. При патологических примесях в испражнениях (слизь, кровь, гнои и т.п.) их включают в отбираемую пробу.

б. Рвотные массы и промывные воды желудка забирают в объёме до 100мл. Для исследования используют первые порции промывных вод, полученные без применения дезинфицирующих средств. При кислых значениях рН рвотных масс перед посевом их нейтрализуют 10% раствором бикарбоната натрия, промывные воды центрифугируют 15 мин при 3 000 об/мин и в дальнейшем используют осадок. В случае невозможности центрифугирования допускают посев нативного материала.

в. Жёлчь (дуоденальное содержимое) отбирают в стерильные пробирки. При этом отдельно собирают дуоденальное содержимое, пузырную жёлчь и жёлчь из жёлчных протоков (порции А, В и С). Кислая среда, белесоватый оттенок, хлопья делают материал непригодным для бактериологического исследования.

г. Моча. Забирают после тщательного туалета наружных половых органов; первую порцию отбрасывают, остальную в количестве 20-30 мл собирают в стерильную посуду. Мочу центрифугируют 15 мин при 3 000 об/мин, для исследования используют осадок. Однако допускают высев и нативного материала. С наибольшей частотой сальмонеллы в моче обнаруживают на 2-3 нед заболевания.

д.Спинномозговая жидкость.

Исследуют при менингеальном или менингоэнцефалитическом синдроме. Пробу (3-5 мл) помещают в стерильную пробирку и доставляют в, лабораторию, предохраняя материал от замораживания (можно использовать термос). К. Дополнительные материалы для исследования — биоптаты костного мозга (0,5-0,75 мл засевают на среду обогащения), мокрота (гнойные комочки засевают на среду Плоскирева и КА), розеолы (скарифицируют, наносят 1-2 капли жёлчного бульона, отсасывают и засевают на жёлчный бульон), молоко кормящих матерей. При необходимости (при оперативных вмешательствах или летальном исходе) для исследования отбирают операционный и секционный материал. Масса пробы должна быть не менее 20 г.

Забор смывов с оборудования и других объектов окружающей среды проводят стерильными ватными или ватно-марлевыми тампонами. Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют средой обогащения (забуференная пептонная вода с рН 7,0), наклоняя пробирку; излишек влаги отжимают о стенку пробирки. Смывы берут с площади не менее 100 см2, если нет специальных указаний для данного объекта. При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

2. Посев на питательные среды

а. Среды. В качестве сред обогащения используют селенитовый бульон с аминопептидом селенитовую и магниевую среду, тетратионатовый бульон Мюллера, среду Кауффмана 20% жёлчный бульон. Среди дифференциально-диагностических сред для первичных посевов материала и высевов со сред обогащения выделяют высокоселективные (например, висмут-сульфитный агар или агар с бриллиантовым зелёным), среднеселективные (среда Плоскирева, слабощелочной питательный агар) и низкоселективные (агар Эндо и Левина}. На средах для первичной идентификации (агар Клиглера, комбинированная среда по Олькеницкому, среда Ресселя) определяют ферментацию лактозы (на среде Олькеницкого — и сахарозы), глюкозы, способность образовывать сероводород и газ, гидролиз мочевины. Для биохимической идентификации используют среду с мочевиной по Кристенсену, среду с мочевиной по Преусу, среду Кларка, среды с углеводами, среды для определения индолообразования, среды с аминокислотами (лизином, орнитином, аргинином), глицериново-фуксиновый бульон Штерна и полужидкий агар для определения подвижности.

б. Подозрительные колонии (не менее трёх) пересевают в пробирки со скошенной или одной из комбинированных сред (Олькеницкого, Клиглера, Ресселя). В случае эпидемической вспышки из подозрительных колоний (параллельно с пересевом на комбинированную среду) проводят высев на МПА для последующей постановки реакции агглютинации. Результаты этой реакции требуют подтверждения на этапе завершения биохимической идентификации. Одновременно изучают морфологию и тинкториальные свойства бактерий, готовя мазки и окрашивая их по Граму. При отсутствии подозрительных колоний чашки с висмут-сульфитным агаром оставляют в термостате еще на 24 ч, после чего просматривают и при обнаружении подозрительных колоний продолжают исследования. В противном случае работу с посевами прекращают. Возбудитель паратифа В может давать сплошной слизистый рост или феномен валообразования (образование слизистого валика по периметру колоний).

в. Для дальнейшей работы отбирают колонии, уреазаотрицательных бактерий, ферментирующих глюкозу, неферментирующих сахарозу и образующих H₂S. Культуры, пересеянные со среды Олькеницкого в среду Гисса с маннитом, 1 % пептонную воду для определения образования индола и в полужидкий агар для определения подвижности. При выделении культур, имеющих ферментативные свойства, характерные для сальмонелл, изучают антигенную структуру в реакции агглютинации на стекле с О - и Н-агглютинирующими диагностическими антисыворотками, а также определяют биовары. По результатам реакции агглютинации ставят окончательный бактериологический диагноз, а исследование прекращают.

г. В последнее время широко распространились дифференциально-селективные ксилозо-лизин-деоксихолатные (XLD-агар) среды для сальмонелл и шигелл (SS-агар); выросшие на них колонии сальмонелл красные с чёрным центром (за счёт образования H₂S). Однако эти среды не более селективны, чем висмут-сульфитный агар или агар с бриллиантовым зелёным.

3. Серологические исследования проводят для диагностики, а также выявления и дифференциации различных форм носительства.

Лабораторная диагностика иерсиниозной инфекции.

Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica патогенны для различных животных и иногда для человека, вызывая брыжеечный лимфаденит, хроническую диарею и тяжёлые септицемии

Наиболее достоверный результат, подтверждающий диагноз, получают выделением иерсиний из патологического материала. Данные бактериологических исследований не менее важны для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих с лихорадкой, лимфаденопатиями и энтероколитами.

Материал – кровь, испражнения, продукты питания, вода. Материал засевают на среды Эндо, Плоскирева, Наиболее оптимальные среды для Y. enterocolitica — агар с цефсулодином, иргазаном и новобиоцином, а также агар МакКонки. На плотных средах колонии Y. enterocolitica мелкие, блестящие, часто выпуклые с голубоватым оттенком в проходящем свете. При культивировании (48 ч при 37 °С) на среде Эндо колонии имеют розоватый оттенок. Полиморфизм колоний выражен слабо. При старении у Y. enterocolitica часто отмечают сливной рост.

Колонии Y. pseudotuberculosis отличают серовато-желтоватый оттенок в проходящем свете и меньшая прозрачность. При культивировании (48 ч при 37 °С) на среде Эндо колонии Y. pseudotuberculosis остаются бесцветными. Часто образуют R-формы — выпуклые, бугристые, с фестончатой зоной (или без неё), напоминающие колонии Y.pestis.

Все штаммы Y. enterocolitica имеют поверхностный Аг энтеробактерий, общий с прочими представителями семейства. По О-антигену все штаммы подразделяются на 34 серовара. От больных чаще всего выделяют О3 и О9 серовары, реже – О6, О7, О8,О5.

Возбудитель псевдотуберкулеза по О-антигену разделяют на 8 серогрупп (I—VIII) c 20 О-факторными антигенами. По О-антигену и Н-антигену этот вид подразделябт на 13 сероваров и подсероваров (Ia, Ib, IIa, IIb IIc, III, IVa, IVb, Va, Vb, VI, VII, VIII. От больных чаще всего выделяют штаммы, относящиеся к сероварам Ib, III и IV.

Окончательное типирование осуществляется с помощью агглютинирующих сывороток: для Y. enterocolitica – О; для Y.pseudotuberculosis -- О и Н. Антитела в сыворотках больных определяются при постановке РА развёрнутой или РПГА. Диагностический титр РПГА – 1:400 и выше.

Таблица 3