Praktikum_biology_1_kurs

Отже вся мікрофлора водних джерел умовноподіляється на дві великі групи: автохтонна (постійна, природна) – актиноміцети, мікрококи, псевдомонади, спірохети, непатогенні вібріони і заносна – при забрудненні водоймищ стічними водами – кишкові палички, ентерококи, клостридії, спірили, вібріони, ентеровіруси, ротавіруси.

Бактеріологічні дослідження води проводять з метою:

1.Визначення загальної кількості мікроорганізмів в 1 мл води.

2.Виявлення санітарно-показникових мікроорганізмів, тобто бактерій, які вказують на фекальне забруднення.

3.Виявлення у воді патогенних форм, їх токсинів і бактеріофагів.

Відбір проб води

Залежно від задачі дослідження визначають місце і час відбору проби.

Для проведення мікробіологічного аналізу відбирають 500 см3 води у стерильні флакони, закриті ватно-марлевим короком, покритимю зверху паперовим ковпачком. Якщо дослідження проводять на виявлення не лише індикаторних а й патогенних мікроорганізмів, потрібно брати пробу об’ємом 2500 см3 води. Коли визначають ще й індекс коліфагів об’єм проби збільшують до 3500 см3

Взяття проб з водопровідних кранів проводять після випускання води протягом 10 хв і обпалювання спиртовим факелом зони відбору проби.

Для дослідження води відкритих водойм, а також колодязів проби беруть за допомогою батометра (рис. 90).

На потрібній глибині корок відкривають, потягнувши за шнур. Після заповнення флакона його відпускають, завдяки чому ємність автоматично закривається. Після виймання флакона з батометра притертий корок замінюють ватно-марлевим. Як правило, пробу води беруть на глибині 15 см, але не ближче як за 10...15 см від дна водойми.

На флакон із відібраною водою наклеюють

Рис. 90. Батометри етикетку, на якій вказують місце взяття проби, її номер, дату і час, температуру води й повітря,

прізвище санітарного лікаря чи його помічника, мету дослідження й адресу лабораторії, яка буде проводити аналіз.

Бактеріологічне дослідження відібраних проб повинне проводитися не пізніше 2 год з моменту відбору або не пізніше 6 год за умовии збереження проби при 1...5° С.

Методи визначення мікробного числа

У 1 мл досліджуваної води визначають вміст мезофільних аеробів і факультативних анаеробів, здатних при 37° С впродовж доби на МПА утворювати колонії, видимі неозброєним оком чи при збільшенні в 2...5 разів. З кожної проби роблять посів не менш двох різних об’ємів, обраних з таким розрахунком, щоб число вирослих колоній на чашці коливалося від 30 до 300.

121

У ході дослідження водопровідної води в кожну з двох чашок вносять по 1...0,1 мл чистих вод і по 0,01 і 0,001 мл більш забруднених. При визначенні мікробного числа сильно забруднених вод і стічних рідин досліджують по

0,0001 і 0,00001 мл.

Для посіву 0,01 мл і менших об’ємів досліджувану воду розводять стерильною водопровідною водою. Готують послідовно 10-кратні розведення.

На поверхню застиглого і підсушеного середовища наносять по 0,1 мл кожного розведення і за допомогою стерильного шпателя розподіляють його по всій поверхні. Засіяні чашки залишають на 1...2 хв., для того, щоб проба всмокталася у агаризоване середовище, перевертають догори дном і поміщають у термостат. Посіви вирощують протягом доби при 37° С. Підраховують усі вирослі колонії. Враховують результати тільки на тих чашках, де число колоній коливається в межах від 30 до 300, і роблять перерахунок вмісту бактерій у 1 мл досліджуваної води за формулою 1.6.

Методи визначення кількості бактерій групи кишкової палички (БГКП). До категорії БГКП належать бактерії родини Enterobacteriaceaе, що обєднує роди

Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це грамнегативні, безспорові,

оксидазонегативні палички, які ферментують глюкозу і лактозу до кислоти й газу при 37°С. Вони виділяються в зовнішнє середовище з випорожненнями людей і теплокровних тварин і є кількісним показником ступеня фекального забруднення води. Тому чим більше її фекальне забруднення, тим вища ймовірність контамінації води відповідними патогенними мікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних бактерій, а в ній фекальні кишкові палички (ФКП), які розкладають лактозу при 44,5°С. До E.coli відносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником свіжого фекального забруднення. Для його визначення можна використати S.faecalis, який порівняно швидко гине в оточуючому середовищі.

Для повноцінного санітарно-мікробіологічного дослідження води визначають ЗМЧ, БГКП, E.coli, ентерококи, стафілококи, патогенні мікроорганізми (холерні вібріони, сальмонели, шигели, лептоспіри, ентеровіруси та ін.).

Загальноприйнятим показником санітарно-мікробіологічного дослідження води є показник колі-індекс, тобто кількість бактерій групи кишкових паличок у 1л (дм3) води або колі-титр – найменша кількість води, у якому ще виявляється кишкова паличка.

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок. Цей показник

(індекс БГКП) визначають за допомогою методу мембранних фільтрів і бродильним методом. Мікробіологічні лабораторії частіше використовують метод мембранних фільтрів. Він значно простіший і дає стабільні результати.

Метод мембранних фільтрів. Сутність методу полягає в концентруванні бактерій з певного обєму досліджуваної води на мембранний фільтр, вирощуванні на середовищі Ендо при 37 °С і підрахунку індексу БГКП в 1 дм3 води.

122

При аналізі водопровідної води необхідно фільтрувати не менш як 333 см3. При дослідженні води невідомої якості слід фільтрувати менші обєми:

наприклад 3, 30, 100, 200 см3.

Промисловість випускає нітроцелюлозні мембранні фільтри під шістьма номерами: чим менший номер, тим дрібніший діаметр пор. Для дослідження води використовують фільтри № 2 і № 3. Їх вміщують у підігріту до 80 °С дистильовану воду і ставлять на слабкий вогонь до закипання. Кип’ятять тричі по 15 хв, кожного разу замінюючи воду. Після останнього кип’ятіння воду не зливають, фільтри залишають в ній до вживання.

Для фільтрування води використовують апарат Зейтца або аналогічний прилад (див. рис. 72).

Прилади обтирають ватним тампоном, змоченим у спирті, і фламбують. Після охолодження їх монтують на колбі Бунзена. На нижню частину апарата (столик) кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний фільтр, притискають його верхньою частиною приладу (стакан, воронка) і закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією. У воронку (стакан), дотримуючись правил асептики, наливають досліджуваний обєм води й за допомогою масляного насоса створюють вакуум у колбі Бунзена. Після закінчення фільтрування знімають воронку (стакан), мембранний фільтр беруть профламбованим на вогні пінцетом і вміщують на середовище Ендо так, щоб між середовищем і фільтром не було бульбашок повітря. В одній чашці Петрі можна розмістити 3...4 фільтри. Чашки з фільтрами на середовищі Ендо вміщують у термостат догори, інкубують при 37°С протягом 18...24 год. Аналізують кількість типових рожевих колоній з металевим блиском, характерних для E.coli

Мікробіологічні показники безпеки питної води згідно Державних санітарних норм та правил «Гігієнічні вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною» (ДСанПіН 2.2.4-171-10) наведено у табл. 7.

123

Продовження табл. 7

Примітки:

* Для 95 % проб води, відібраних з водопровідної мережі, що досліджувались протягом

року.

**Через 10 років з часу набрання чинності Санітарними нормами.

***Для 98 % проб води, відібраних з водопровідної мережі, що досліджувались протягом року.

****Визначають додатково у питній воді з поверхневих вододжерел у місцях її надходження з очисних споруд в розподільну мережу, а також в ґрунтових водах, БУО – бляшкоутворювальні одиниці.

*****Визначають під час виробничого контролю перед розливом питної води в тару.

Дослідження питної води з поверхневих вододжерел чи ґрунтової води за показниками, передбаченими пунктами 5 та 7, проводяться у разі виявлення в двох послідовно відібраних пробах води загальних коліформ, E.coli, ентерококів чи коліфагів (пп. 2, 3, 4, та 6), а дослідження питної води з підземних артезіанських і міжшарових безнапірних водоносних шарів за показниками, передбаченими пп. 5, 6 та 7, проводяться у разі виявлення в двох послідовно відібраних пробах води загальних коліформ, E.coli чи ентерококів (пп. 2, 3, 4). При цьому дослідження води на вміст збудників інфекційних хвороб вірусної етіології проводяться у разі виявлення в її пробах коліфагів, а на вміст збудників бактеріальної етіології - у разі виявлення в її пробах загальних коліформ, E.coli чи ентерококів.

16.2. Мікробіологічні методи дослідження повітря

Повітря не є середовищем мешкання мікроорганізмів, але є транзитним середовищем.

Мікрофлору повітря можна умовно розділити на постійну, що часто зустрічається, і змінну, представники якої, потрапляючи в повітря з властивих їм місць поширення, недовго зберігають життєздатність. Постійно у повітрі виявляються пігментоутворювальні коки, палички, дріжджі, гриби, актиноміцети, спороносні бацили і клостридії тощо, тобто мікроорганізми, стійкі до світла, висихання. У повітрі великих міст кількість мікроорганізмів більша, ніж у сільській місцевості. Над лісами, морями повітря містить мало мікробів (у 1 м3 – поодинокі мікробні клітини). Дощ і сніг сприяють очищенню повітря від мікроорганізмів.

Уповітрі закритих приміщень мікробів значно більше, ніж у відкритих

повітряних басейнах, особливо узимку, за умови недостатнього провітрювання. Склад мікрофлори і кількість мікроорганізмів, що виявляються в 1 м3 повітря (мікробне число повітря), залежать від санітарно-гігієнічного режиму, числа людей, що знаходяться в приміщенні, стану їхнього здоров'я й інших умов.

Уповітря можуть попадати і патогенні мікроорганізми від тварин, людей (хворих і носіїв). .

124

Для мікробіологічного дослідження повітря користуються методами, в основу яких покладені осідання (седиментація) і аспірація. За допомогою седиментаційних методів можна одержати загальне уявлення про мікроорганізми, що зустрічаються в повітрі. Аспіраційні методи дають можливість визначити не тільки якісний, але і кількісний вміст бактерій у певному об’ємі повітря.

16.2.1. Метод осідання (седиментаційний). Найпростіший метод бактеріологічного дослідження повітря – метод осідання, що заснований на осіданні бактеріальних часток і крапель під впливом сили тяжіння на поверхні агару відкритої чашки Петрі. Чашки з МПА експонують 5...10...15 хв залежно від передбачуваного бактеріального забруднення. Метод осідання не дає точного кількісного уявлення про вміст мікрофлори в повітрі, оскільки на відкритих чашках погано уловлюються тонкодисперсні фракції бактеріальних крапель і пилових часток, а затримуються головним чином великі пилові частки, що осідають чи прибиваються струмами повітря до поверхні середовища. Тому перерахунок за Омелянським (на поверхню 100 см2 агаризованого середовища осідає за 5 хв така кількість бактерій, що міститься в 10 л повітря) має великі похибки при кількісному вивченні мікрофлори повітря приміщень і абсолютно не придатний для атмосферного повітря, де мають місце великі коливання у швидкості його руху. Проте метод осідання може бути використаний у тих випадках, коли відсутні більш доскональні прилади і методи або коли немає джерела електроенергії. Для розрахунку мікробного числа повітря використовують наступну формулу:

де X - кількість мікроорганізмів у 1 м3 повітря; а - кількість колоній у чашці; в — площа чашки (в = 78,5 см2); τ — час експозиції; 5 — час експозиції за який відбувається осідання мікроорганізмів з об’єму повітря 10 л на площу

100см2; 1000 – перерахунок на 1 м3.

16.2.2.Метод влювлювання (аспіраційний). Найпростіші аспіраційні методи засновані на уловлюванні бактерій рідиною. Через судину з певним об’ємом ізотонічного розчину NaCl чи водопровідної води продувають (за допомогою повітродувки, пилососа, насоса тощо) певний об’єм повітря. Потім проводять висів на МПА по 0,1...0,2 мл рідини, що уловлювала. У випадку більшого об’єму отриманої суспензії всю її і частину рідини, що уловлює, фільтрують через мембранні фільтри №2 або №3 з наступним посівом фільтрів на поверхню щільних поживних середовищ.

Серед приладів для дослідження повітря приміщень найпоширенішим є прилад Кротова (рис. 91).

125

Рис. 91. Апарати для аспіраційного аналізу повітря: а,б – апарат Кротова; в – повітрязабірник SAS SUPER ISO

Механізм уловлювання мікрофлори ґрунтується на ударно-прибивній дії струменя повітря, що проходить через вузьку клиноподібну щілину і з великою швидкістю вдаряється об вологу поверхню поживного середовища. У результаті удару аерозолі, що знаходяться у повітрі, у тому числі пилові частки і краплі, що містять бактерії, прибиваються до поверхні МПА чи елективних середовищ. Під час відбору проби повітря чашка Петрі обертається разом зі столиком, завдяки чому досягається рівномірне обсіменіння поверхні агаризованого середовища мікрофлорою повітря. Для відбору проб варто підбирати чашки Петрі з плоским дном, а кількість поживного середовища у чашці не повинно перевищувати 15 мл.

Прилад Кротова характеризується ефективністю уловлювання мікрофлори в пиловій фазі аерозолю, дає чіткі порівнянні результати, простий у роботі, дозволяє за короткий час зробити відбір проб повітря безпосередньо на чашки Петрі з МПА або елективними середовищами. Продуктивність приладу від 20 до 40 л/хв. Основний недолік приладу полягає в тому, що він потребує для роботи електроенергію; це обмежує можливості його застосування для дослідження атмосферного повітря. Цього недоліку позбавлені сучасні прилади для аспіраційного аналізу повітря (рис. 91, в), в конструкції яких передбачені електричні акумулятори.

Хоча офіційних стандартів чистоти повітря не розроблено, прийняті приблизні показники, за якими оцінюється ступінь мікробного забруднення повітря житлових приміщень (табл. 8)

Таблиця 8

Показники мікробного забруднення повітря житлових приміщень

126

* Санітарно-показовими мікроорганізмами повітря закритих приміщень є: золотавий стафілокок – Staphylococcus aureus, гемолітичний стрептокок Streptococcus haemolytіcus та стрептокок, що зеленить – Streptococcus vіrіdans.

Завдання на виконання

1.Закінчити роботу із визначення кількісного і якісного складу мікрофлори ґрунту. Результати спостережень занести у таблицю. Зробити висновок.

2.Ознайомитись з методами аналізу мікрофлори повітря. Розпочати аналіз мікрофлори повітря седиментаційним методом.

3.Ознайомитись з правилами відбору проб води з поверхневих водних джерел та водогонів. Зробити висіви питної води, розведень води з природних поверхневих джерел та стічної води для виявлення загального мікробного числа на МПА та індексу БГКП на середовище ЕНДО.

4.Чашки з посівами загорнути у папір, підписати, зазначивши: назву дослідження, дату посіву, шифр академічної групи, прізвища виконавців. Далі

чашки з посівами, перевернути догори дном, поставити у термостат на 30°С (з середовищем Ендо – на 37°С).

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 16, у якому повинно бути відображено:

1. Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

Теоретичні відомості: Мікробіологічні методи дослідження води. Автохтонна і заносна мікрофлора водних джерел. Санітарно-показові мікроорганізми води. Правила відбору проб води. Методи визначення мікробного числа. Поняття про колі-індекс та колі-титр. Мікробіологічні методи дослідження повітря: метод осідання (седиментаційний) та метод влювлювання (аспіраційний). Показники, за якими оцінюється ступінь мікробного забруднення повітря житлових приміщень.

2. Практична частина – виконати рисунки одержаних мікроскопічних препаратів у лабораторному зошиті, супроводити їх поясненнями; намалювати схему послідовності операцій мікробіологічного аналізу води на ЗМЧ та індекс БГКП. Накреслити таблиці дослідження мікробіологічних показників води та повітря, результати до якої будуть одержані та внесені на наступному занятті:

Аналіз мікрофлори води

127

У висновку до роботи необхідно зазначити принципи і методи мікробіологічного аналізу води і повітря, використані на лабораторному занятті та порівняти одержані мікробіологічні показники з нормованими значеннями.

Контрольні запитання

1.З якою метою проводять мікробіологічні дослідження води?

2.Охарактеризуйте автохтонну і заносну мікрофлору різних водних джерел.

3.Які санітарно-показові мікроорганізми використовуються для аналізу мікробіологічного стану води?

4.Назвіть правила відбору проб води.

5.Охарактеризуйте методи визначення мікробного числа.

6.Дайте визначення понять «колі-індекс» та «колі-титр».

7.Охарактеризуйте мікробіологічні методи дослідження повітря: седиментаційний та аспіраційний. Зазначте їх переваги та недоліки.

8.За якими показниками оцінюється ступінь мікробного забруднення повітря житлових приміщень?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 17

Мікробіологічні методи аналізу об`єктів навколишнього середовища (закінчення).

Нормальна мікрофлора людини

Мета роботи: ознайомитись з характеристикою, таксономічним статусом та опанувати методи дослідження мікроорганізмів, які належать до нормальної мікрофлори людини.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; крапельниці з дистильованою водою; фільтрувальний папір; спиртівки; набір барвників. Крім того на кожну бригаду: 1 чашка Петрі з МПА.

Загальні відомості

Нормальна мікрофлора тіла людини характеризується сталістю, є результатом взаємного пристосування макро- і мікроорганізмів у процесі еволюції й нагадує щось подібне до ектосимбіозу мікробів з організмом людини. Разом з цим на поверхню людського тіла потрапляє також чимало випадкових мікроорганізмів.

Отже, мікрофлору людини можна умовно поділити на такі групи:

∙постійна (резидентна) – мікрофлора специфічна для даного біотопу (автохтонна);

∙тимчасова – мікрофлора занесена з інших біотопів хазяїна (алохтонна);

∙заносна – мікрофлора, занесена з інших біотопів довкілля.

128

Організм людини населяють понад 500 видів бактерій, біля 50 видів вірусів і понад 20 видів найпростіших. Загальна кількість мікроорганізмів досягає 1014, що в 10 разів більше, ніж всіх клітин макроорганізму.

Найчастіше забруднюються мікробами відкриті частини тіла людини. Наприклад, на руках інколи можна виявити стафілококи, кишкову паличку, паличку правця і газової гангрени, мікобактерії та дифтерійні коринебактерії, спори різних грибів тощо. Тільки на шкірі однієї людини може бути понад мільярд мікробів. У ротовій порожнині виявляють понад 100 видів мікроорганізмів (рис. 92). Найбільше мікробів міститься в товстому кишечнику людини. Встановлено, що доросла людина виділяє щодня з екскрементами близько 17 трильйонів мікроорганізмів.

Бактерії нормальної мікрофлори не спричинюють захворювань, якщо вони випадково не попадають у захищені внутрішні ділянки тіла людини або якщо не настають різкі фізіологічні зміни в організмі. Кожна частина тіла людини забезпечує особливу екологічну нішу, для якої

характерна певна мікрофлора. Важливою особливістю

нормальної мікрофлори є її індивідуальність й анатомічна стабільність.

В різних ділянках тіла вона неоднакова, оскільки кожний біотоп характеризується своєрідними умовами для існування мікроорганізмів. Найбільше епідеміологічне значення мають представники мікробних угруповань

шкіри, верхніх дихальних шляхів, шлунково-кишкового тракту, сечо-статевих органів. Методи дослідження мікрофлори різних біотопів значною мірою відрізняються між собою. Дослідження мікрофлори людини проводять для діагностики ендогенних інфекцій, дисбактеріозів, бактеріоносійства у космонавтів, членів екіпажів підводних човнів та полярних експедицій для уникнення бактерійної несумісності.

До складу, так званої, мікрофлори тіла людини належать такі найпоширеніші представники мікросвіту: Sarcina, Streptococcus, Micrococcus,

Bacillus (шкіра), Neisseria, Lactobacillus, Bacteroides, Spirillum, Spirochaeta (ротова порожнина), Staphyllococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Micrococcus (дихальні шляхи), Sarcina, St. faecalis, Bacteroides, Escherichia, Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium perfringens, Candida (шлунково-кишковий тракт) та багато інших.

Ознайомлення з мікрофлорою тіла людини має дуже важливе значення, оскільки порушення санітарно-гігієнічного режиму є причиною різних важких захворювань, особливо шлунково-кишкових (дифтерія, холера та інші).

129

Мікрофлору тіла людини можна визначати різними методами. Для цього роблять посіви з пальців рук, зіву, випорожнень тощо.

Проведення мікробіологічного аналізу. Найпростіший посів здійснюється доторканням пальців, стерильних тампонів з зубним нальотом до поверхні поживного середовища (утворення так званих «відбитків»). Частіше посів на поверхні середовища проводять за допомогою бактеріологічної петлі зі змиву рук. Щоб отримати змив, пінцетом беруть стерильний ватний тампон, змочують його в 0,85 %-му розчині NaCl і протирають шкіру між пальцями, нігті тощо. Після цього тампон кладуть у пробірку зі стерильним глюкозопептонним середовищем і перемішують деякий час, обережно обертаючи пробірку між долонями.

3асіяні чашки Петрі розміщують у термостаті при температурі 37°С на 24 год. Виймають чашки і витримують їх протягом 2...3 днів при кімнатній температурі. За цей час утворюються колонії сарцин, стафілококів, різних пігментних бактерій, цвільових і дріжджових грибів тощо. З метою ідентифікації найпоширеніших мікроорганізмів вивчають їхні культуральні, морфологічні та інші властивості.

Завдання на виконання

1.Закінчити роботу по визначенню кількісного і якісного складу мікрофлори води. Результати спостережень занести у таблицю. Зробити висновок.

2.Закінчити роботу по визначенню кількісного і якісного складу мікрофлори повітря. Результати спостережень занести у таблицю. Зробити висновок.

3.Розпочати аналіз нормальної мікрофлори людини. Для цього зовнішній бік дна чашки Петрі із стерильним середовищем МПА розділити за допомогою олівця по склу на 3 сектори за зразком, наведеним нижче. Кожен сектор

позначити: В – волосся; З – зуби; П – пальці.

Здійснити посів доторканням пальців (сектор «П»), доторканням стерильних тампонів із зубним нальотом до поверхні поживного середовища (сектор «З»), за допомогою профламбованого пінцета залишити волосину на поживному середовищі (сектор «В»). Чашку з посівом загорнути у папір, підписати, зазначивши: назву дослідження, дату посіву, шифр академічної групи, прізвища виконавців. Далі чашку з посівом, не перевертаючи, поставити у термостат на 37°С.

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 17, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості:Загальна характеристика нормальної мікрофлори людини. Методи аналізу мікрофлори людини.

130