3.1.2. Оцінка неспецифічних взаємодій і повторного використання носіїв

1. Виконайте ту ж процедуру для іммобілізації дикого типу номерів відмічених ферментів (стільки ж, скільки використовується для його маркування) на аналогічну функціональних носіях.

2. Перевірте чи фермент обмежена на носії. Це відповідає встановленій з ферментом адсорбції.

3. Іммобілізація з мітками ферментів спорідненістю через хелат металу повністю оборотна при додаванні конкурентних сполук, таких як імідазол (Im) або при видаленні іонів металів з ​​групи NTA з сильнішими такі хелатуючі агенти Етилендіамінтетраоцтова кислоти (ЕДТА). Просте промивання розчином Im або ЕДТА відновлює носії (див. Примітка 7).

4. Усунути фермент пов'язаний спорідненістюі, просто промиванням 0,1 М розчином імідазолу (див. Примітка 8).

5. Усунути іони Ni розчином 0,1 М ЕДТА (див. примітку 9)

3.2. Іммобілізація Глікопротеїну на основі Con a застосовуючи іммобілізацію ацетил холін естерази на амінованих кварц кремнезерах

Процедура іммобілізації була виконана в кілька самостійних кроків починаючи з активації носія. Іммобілізацію проводили з 10 мг діоксиду кварц кремнію, використовувані як носій в 1 мл PBS або карбонат буферів ,забезпечуючи необхідне значення рН реагентів або біокомпонентів використовуваних для кожного кроку. Для кожної фази протоколу реакції проводили в 1,5 мл мікропробі рок Еппендорфа , механічно струшували протягом 2 год на швидкості 4. Видалення реагентів з реакційного середовища було досягнуто шляхом чотирьох циклів миття, кожне з яких, складається з: реакційного середовища центрифугування, видалення супернатанта, вихрові перемішуванням 1 мл буфера протягом 1 хв (див. Примітка 10). Якщо буфер повинен був бути змінений , то перший буфер, використовуваний для перших двох циклів і новий буфер. Останні два кроки миття.

1 . Активацію аміногруп носія проводили перемішуванням гранул в 1 мл карбонатного буфера, що містить 10% DVS ( обсяг / об'єм).

2 . Активовані кульки піддають взаємодії з вуглеводами (метил - α -D- маннопіранозида ) в 1 мл 10% - DVS розчину ( див. рис. 3А ) .

3 . Непрореаговані DVS активовані аміногрупи і адсорбції ділянки блокувалися 1 мл BSA (10% т / х в карбонатного буфера) .

4 . 1 мг Con А розчиняли в 1 мл PBS додавали на кульках і лектин був іммобілізованим.

5 . Різні кількості ферменту ( 0,3-3,3 U АХЕ) були іммобілізовані на носії через біорозпізнавальний механізму .

6 . Для усунення неспецифічної адсорбції , кінцеве промивання виконують після іммобілізації ферментів протягом 12 годин при перемішуванні кульок в 20 мл PBS з додаванням 1 М KCl , при 4 ° С ( 16).

7 . Неспецифічну адсорбцю АХЕ оцінювали шляхом реплікації іммобілізації, але на цей раз був заблокований лектином з 1 мл 10 % -метил- α -D маннопіранозідом в PBS до контакту з ферментом (див. рис. 3В ) . Крім того ,фермент розчиняли в PBS , які також містять 10% метилового ефіру α -D- маннопіранозида для того , щоб забезпечити безперервну конкуренцію між глікопротеїном ​​і цукором для лектину від носія .

3.3. Застосування методів афінної іммобілізації до побудови трафаретного друку обслуговування

біосенсорів

1. Ампероментричні біосенсори були виготовлені в нашій лабораторії за допомогою технології трафаретного друку. Процедура складається з послідовного осадження з декількох шарів на пластмасову основу.

2. Потім згідно з процедурою афінної іммобілізації, специфічна композитниа паста з або без ферменту наносили на поверхню робочої поверхні електрода. Для цього конкретного застосування робочого електрода було використано в якості основного носія для остаточної іммобілізації ферменту.