Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
ПЕРЕВОД.docx
Скачиваний:
3
Добавлен:
12.02.2016
Размер:
39.07 Кб
Скачать

Affinity іммобілізації ферментів міткою

Сільвана Андрееску , Богдан Букур , і Жан -Луї Марті

Резюме

Розробка нових методів іммобілізації ферментів, що не впливають на каталітичну діяльністьі конформаціює важливим завданням дослідження. Маркери спорідненості, які присутні або додані в певній позиції далеко від активногомісця перебуванняв складі нативних білків можутьбути використанідля створення міцних зв'язків спорідненіихміж структурою ферменту і твердимносієм, функціоналізованих з комплементарними аффінним лігандом. Широкарізноманітність спорідненостісистем створює багато можливостей для іммобілізації ферментів. Ця робота описує експериментальні стратегії для афінної іммобілізації мічених ферментів на підкладках. Протоколи для прикріплення гістидину ( His ) та цукор - мічених ферментів на загальних опорах такі як комерційні аміновані кульки кремнезему і активованого графіт-целюлозою описані докладно. Такі стратегії носять загальний характер і можуть бути використані в будь-яких цілях, що вимагають іммобілізації біокаталізаторів, оформлені, що робить майбутнє технологій ферменту більш чутливими, більш простими, здатними до повторного використання, і менш дорогими. Обговорюється стратегія для видалення неспецифічних адсорбції та приклади можливого застосування цих методів для ферментних датчиків.

Ключові слова: маркування ферментів ; спорідненістю іммобілізації ; гістидин ; NTA; конкавалін А.

Введення

В останні роки на прогрес в методах іммобілізації значно вплинув на конструкцію і робочі характеристики різних ферментативних систем , починаючи від біореакторів для значного числа біосенсорів. Іммобілізація ферментів має велике значення для практичного використання. У іммобілізованому стані ферменти є більш стабільними і можуть бути використані повторно , тим самим значно скорочуючи витрати , пов'язані з іммобілізацією . Багато зусиль були спрямовані на пошук процедури іммобілізації , який підтримує найкращу характеристику ферментативної системи . Є кілька вимог для вибору іммобілізації методу : ( 1) збереження активності ферменту і підтримання його якомога ближче до вихідного положення , ( 2 ) забезпечення стабільності біомолекули , ( 3) низький рівень вартості (4) достатня чутливість і селективність відносно аналізованої речовини. Крім того, відповідний вибір обумовлений видом та характером ферменту і / або носія , а також кінцевого застосування системи . Різноманітні методи, такі як адсорбція , ковалентне зв'язування з використанням біфункціональних реагентів фізичне захоплення в полімерній матриці, самоорганізованих моношарів ( SAM ) , або плівок Ленгмюра - Блоджетт були використані для іммобілізації ферментів нарізних поверхонь. Оскільки загальна продуктивність пристроїв на базі іммобілізованих білків сильно залежить від цього процесу , інтенсивні зусилля потрібно підтримуватися в інтересах розробки успішних процедур іммобілізації. Новий напрям в іммобілізації ферментів дає можливість створення окремих (біо ) споріднених облігацій між " активованою " поверхнею і специфічними функціональними групами , присутніми на білковій поверхні . У цьому випадку іммобілізація ферментів досягається за допомогою афінного залишку у специфічному положенні білкової послідовності , яка не впливає на активність або складання білка. Проста прив'язка цього модифікованого ферменту виконується на підкладці . Ця процедура дає кілька переваг , включаючи селективність та орієнтацію іммобілізації,подібну для всіх біомолекул через однаковий зв’язок «сайт зв'язування або конкретної групи» (у цьому випадку, тільки спорідненість залишку представлена ​​на поверхні білка) , мінімізація конформаційних змін , викликаних в структурі ферменту , і можливість перезавантаження тієї ж активованої поверхні з ферментом і повторно використовувати поверхню у відповідності з різними вимогами. Існують дві основні вимоги для іммобілізації ферменту конкретними взаємодіями спорідненості : ( 1) вибір біосумісної поверхні , яка повинна або володіє необхідними функціональними групами (з дуже високою спорідненістю ) і здатна до специфічного розпізнавання даної цільової групи,які знаходяться на зовнішній поверхні білка,або які можуть бути легко функціоналізовані (2 ) наявність конкретних груп на поверхні ферменту.

Вибір біосумісного матеріалу має важливе значення. У більшості випадків матеріалу не відповідає всім потребам іммобілізації ферментів і тому вимагає подальших кроків функціональних груп. З цієї причини необхідно виявлення та / або внесеннярізних груп на поверхню( Наприклад , -NH2 , -COOH, -OH, ...) , на якій "розумні"ланцюги можуть бути з’єднані.Такі лінкери володіють високою спорідненістю до певної групи ферменту. Вони можуть бути виконані у вигляді сандвіч - подібноїструктури (підтримка конкретних компонувльних ферментів), зазвичай реалізується шар за шаром в послідовниминезалежнимикроками розділенимипральними надлишковими агентамиактивації. Це дає можливість оптимізаціїі всього процесу фіксації , так що білок є сильно зв'язанимна носіїв конкретній точці , уникаючи при цьому денатурації процесів ферменту. Кілька попередньо активованих мембран є доступними і і можуть бути використані в якості носіїв для іммобілізації ферментів з використанням цього методу.

Аффінні мітки , такі як гістидин ( His ) , цистеїн ( Cys ) або манноза -зв'язуючі білки можуть брати участь у спорідненістю зв'язування (5-9 ) . Проте , хоча багато ферментів містять такі залишки в їх амінокислотних послідовностях , їх число дуже обмежене , дуже мало хто з них розташовані на поверхні білка ( 5 ) і доступні для зв'язування з носієм . Більше того, методи генної інженерії роблять можливим виробництво мічених білків шляхом приєднання до афінної мітки аміно- або карбоксильні залишки досить далеко від активного центру зменшують просторові труднощі під час біокаталитичних процесів і розширюють область застосування цього типу іммобілізації ферментів в відсутність необхідного цільову групу від їх послідовності (10,11 ) .У цій главі пропонується і обговорюється розвиток двох підходів спорідненістюдля іммобілізації мічених ферментів : один на основі металевих хелатній аффинной( MCA ) і один на основі конканавалін A ( Con A ) (12-15 ) .

Матеріали