6. Комбінативна форма мінливості бактерій

На відміну від еукаріот, у яких в процесі статевого розмноження відбувається взаємний обмін фрагментами чоловічих і жіночих статевих клітин, у прокаріот немає статевого розмноження. Однак, генетичний обмін з утворенням рекомбінаційних генів між мікроорганізмами є можливим і необхідним. Рекомбінація у прокаріот можлива в результаті внутрішньогеномних перебудов, а також при проникненні в клітину — реципієнт частини ДНК клітини-донора, в результаті чого утворюються неповна зигота - мерозигота.

Комбінативна форма мінливості є геномною, вона успадковується і може відбуватися при процесах трансформації, трансдукції (а також лізогенної конверсії) і кон’югації.

Трансформація — перетворення одного різновиду бактерій в інший у результаті безпосередньої передачі фрагменту ДНК від клітини-донора до клітини-реципієнта. Трансформація була відкрита в 1928 році Ф.Гріффітсом в дослідах зараження мишей сумішшю безкапсульного, і тому авірулентного, пневмококу II типу з капсульним, вірулентним, але вбитим нагріванням пневмококом ІІІ типу. Миші гинули від пневмококової септицемії, причому із крові й органів виділялися живі капсульні пневмококи ІІІ типу. Ф.Гріффітс показав, що перетворення безкапсульного пневмококу на капсулоутворюючий відбувається під впливом якоїсь хімічної речовини із вбитих пневмококів IІІ типу. Як уже було зазначено, в 1944 році О. Ейвері, К. Мак-Лауд і К. Мак-Карті встановили, що трансформуючим агентом є ДНК. Зараз доведено, що при трансформації, яка проходить як в експериментальних, так і в природних умовах, бактерія-реципієнт одержує невеликий фрагмент ДНК донора, який звичайно містить один ген. Цей фрагмент включається до структури хромосоми реципієнта, привносячи нову спадкову ознаку. Процес трансформації є важливим механізмом міжгеномного обміну у бактерій і служить для розширення адаптивних можливостей мікроорганізмів.

Трансдукція — перенесення спадкових ознак за допомогою бактеріофагу. При репродукції фагу в бактеріальній клітині в момент збирання фагових часток у голівку фагу може проникнути фрагмент ДНК бактерії-донора (таких фагів може бути близько 0,3 % усього потомства). При проникненні такого фагу в клітину-реципієнт не відбувається лізису бактерій, тому що фаг виявляється дефектним внаслідок втрати частини свого геному, але гени донора рекомбінують із хромосомою реципієнта й останній отримує нові гени і, відповідно, нові спадкові ознаки. При трансдукції переносяться будь-які гени, наприклад, ті, що відповідають за синтез амінокислот, резистентність до антибіотиків тощо.

При трансдукції звичайно не відбувається лізогенізації, зв’язаної з вбудовою геному фагу в бактеріальну хромосому, утворенням профагу. Лізогенна конверсія, зумовлена профагом, також є одним з механізмів комбінативної мінливості бактерій. На цьому процесі ми зупинялися раніше, при характеристиці плазмід.

Кон’югація — перенесення спадкових ознак з клітини-донора до клітини-реципієнта при їх безпосередньому контакті, схрещуванні. Ми також вже розглядали цей процес при характеристиці F-плазміди. Сьогодні кон’югація є досить добре вивченою, але нам навряд чи доцільно на даному етапі вдаватися до подробиць цього процесу. Необхідно лише підкреслити, що саме кон’югація, певно, є головним механізм комбінативної мінливості у бактерій в природних умовах. Цей процес, зокрема, було використано як основний інструмент генетичного аналізу, за допомогою якого встановлена послідовність розміщення генів у хромосомі деяких бактерій, зокрема — E. coli.

Таким чином, різноманітні молекулярно-генетичні механізми зміни генотипу мікроорганізмів (мутаційний та комбінативний) забезпечують появу генетично змінених клітин і створення гетерогенних популяцій мікроорганізмів, з яких шляхом селекціювання в мінливих умовах середовища відбувається формування нових варіантів і поступово здійснюється еволюційний процес утворення нових видів мікроорганізмів.

7. Практичне значення генетики мікроорганізмів і генна

інженерія в медичній мікробіології

Вчення про генетику мікроорганізмів, як це підкреслювалося раніше, стало основою для формування молекулярної біології і молекулярної генетики, встановлення фундаментальних законів успадкування і мінливості, організації матеріальної основи спадковості.

Знання механізмів успадковування і мінливості у мікроорганізмів відіграє важливу роль у розумінні утворення нових різновидів мікроорганізмів, у тому числі і патогенних для людини, під впливом взаємодії з макроорганізмом, його імунною системою, фагами, антибіотиками й антимікробними хіміопрепаратами. Це особливо важливо для розуміння процесів зміни патогенності мікроорганізмів, характеру взаємовідносин між збудником і організмом хазяїна, формування внутрішньолікарняних інфекцій і зміни перебігу інфекційних процесів у сучасних умовах. Безумовно, важливим прикладним значення генетики мікроорганізмів є використання її закономірностей для одержання нових вакцинних штамів, штамів-продуцентів антибіотиків та інших лікарських препаратів з мікроорганізмів.

Досягнення генетики мікроорганізмів дозволили створити новий розділ науки і практики — генну інженерію. Генна інженерія займається конструюванням нових генетичних структур за рахунок штучного комбінування генів.

Загальний принцип створення нових генів генетичних елементів може бути представлений таким чином. ДНК, яка несе потрібний ген, і ДНК вектора-переносника (наприклад, плазміди, фаги або віруси тваринних клітин) обробляються ферментами рестриктазами, які розрізають ДНК в точно визначеній ділянці з утворенням однониткових комплементарних один одному “липких” кінців. Потім за допомогою полінуклеотидлігази зшивають таких фрагментів в одну рекомбінативну молекулу ДНК, яка містить потрібний ген і вектор, забезпечує реплікацію цієї молекули в клітині. Далі рекомбінантну молекулу вводять методом трансформації в клітини E. coli, дріжджів або в клітини тварин. При культивуванні таких клітин одержують продукцію потрібних речовин. Наприклад, за допомогою генної інженерії одержані штами E. coli, які продукують людський інсулін, віруси вісповакцини, що містять гени для синтезу антигенів вірусу гепатиту В, BIЛ та ін., дріжджі, які синтезують гормони і медіатори імунної системи та інші.

Для утворення генно-інженерних бактерій необхідно виконати наступні основні кроки:

1. ДНК, що містить індивідуальний ген, якій використовується для трансплантації, повинна бути виділена з організму донора, або, в деяких випадках, може бути синтезована з нуклеотидів в лабораторних умовах.

2. Повинна бути виділена плазмідна ДНК (екстрахромосомна циклічна ДНК), що служить вектором для переносу індивідуального гену.

3. І донорську, і плазмідну ДНК обробляють ферментом, рестрикційною ендонуклеазою, яка розщеплює або розрізає ДНК так, щоб утворилися комплементарні розгорнуті кінці («липкі кінці»). Ці кінці можуть з’єднуватися з іншими фрагментами ДНК, що мають такі ж комплементарні липкі кінці.

4. «Липкі» кінці уламку донорської ДНК сполучаються з липкіми кінцями плазмідної ДНК, формуючи таким чином модифіковану плазміду з фрагментом ДНК- донора.

5. Плазміду додають до суспензії бактерій-реципієнтів, які сприймають плазміду в процесі трансформації. Ці бактерії, що містять плазміду, ідентифікують та ізолюють.

6. Після цього ідентифікують колонії бактерій, що містять плазміди, які або мають ген або здатні виробляти продукт трансплантованого гену.

8. Генно-інженерні бактерії розмножують у великій кількості, виділяють з культури і очищають продукт (білок) трансплантованого гена.