11. Культура одиночных клеток.

Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции ценным является культивирование отдельных клеток.

Клон– потомство одиночной клетки каллусных тканей.

Одиночная гибридная клетка, выделенная из культуры изолированных протопластов, при дальнейшем ее делении позволяет получить клон, состоящий из гибридных клеток. Это позволяет намного облегчает работу исследователя, т.к. устраняет необходимость отбора потомства в культуре изолированных протопластов от негибридных форм, что связано со значительными трудностями. Одиночные клетки выделяют из клеточных суспензий, из тканей растений, из культуры изолированных протопластов после восстановления клеточной стенки.

Для получения одноклеточной фракции суспензионной культурыиногда достаточно простого отстаивания в колбе в течение 15 – 30 мин: при этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надосадочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агрегаты. Если при отстаивании не удается получить одноклеточную фракцию, применяют мацерирующие ферменты, центрифугирование или фильтрования через сита (нейлоновые или металлические).

Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночную клетку делиться были разработаны специальные методы.

В 1960 г Джонсон предложил метод «няньки», в котором функцию «няньки», стимулирующей деление одиночной клетки, выполняют кусочки каллусной ткани, отделенные от нее фильтровальной бумагой. В присутствии «няньки» одиночная клетка делится и дает индивидуальную колонию клеток, т.е. клон.

Другой метод основан на использовании очень малых объемов богатой по составу питательной среды и связан с культивированием одиночных клеток в микрокапле в чашке Купрака(V=20 мкл) – метод, разработанный академиком Ю.Ю. Глебой. Преимущество данного метода заключается в том, что в микрокаплях удобно наблюдать за делением клеток при соматической гибридизации.

Метод «кормящего слоя»основан на том, что индукция клеточных делений у одиночной клетки может быть связана с применением«кормящего слоя» (это активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растения, что и одиночная клетка).

Стимулирует клеточное деление кондиционирование среды, для чего в исходную питательную среду добавляют питательную среду от интенсивно делящейся культуры клеток.Кондиционирующий факторполучают при фильтровании клеточной суспензии, находящейся в экспоненциальной фазе роста, через бактериальный фильтр.

По сути, все вышеперечисленные методы основаны на использовании выделений из делящихся клеток, т.е. кондиционирующего фактора. Несмотря на многочисленные попытки определить химическую природу и механизм действия кондиционирующего фактора на деление клеток, ясности пока нет, но уверенно можно сказать, что этот фактор термостабилен, водорастворим, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами. Вещество стабильно при рН 4-11.